用于定量測量Vaspin的酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）是基于通過遺傳免疫接種兔子（cDNA Vaspin SC306941）產(chǎn)生的多克隆兔抗血清。Vaspin，也稱為SerpinA12，是一種s氨酸蛋白酶抑制劑，由395個氨基酸組成，形成3個β-折疊和9個α-螺旋。Vaspin的分子量約為45.2 kDa。它不形成多聚體聚集體或分子內(nèi)二硫鍵，并且已知在人血清中沒有結(jié)合蛋白。Vaspin基因不僅在皮下和內(nèi)臟脂肪組織中表達，還在肝臟組織、胰腺1和人表皮（顆粒層角質(zhì)形成細胞/GK細胞）中表達。“血清Vaspin水平在早餐前早晨最高，并且在早餐后2小時內(nèi)降至低水平。血清Vaspin水平在午餐和晚餐前也顯示出餐前上升和餐后下降，盡管程度小于早餐。餐間Vaspin濃度在下午中期達到低點，并在夜間上升，夜間Vaspin水平的峰值約為低點水平的250%。在長時間禁食后不規(guī)律進食顯著降低了血清Vaspin水平，這表明能量攝入本身對血清Vaspin水平有抑制作用。血清Vaspin濃度的晝夜模式與胰島素和葡萄糖的模式w全相反"。

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方法

Vaspin的酶免疫測定是一種所謂的夾心測定法。它利用針對這種蛋白的特異性和高親和力的多克隆抗體。樣本中的Vaspin與微孔板上固定的第一抗體結(jié)合。隨后，生物s標(biāo)記的抗體轉(zhuǎn)而與Vaspin結(jié)合。洗滌后，將添加鏈霉親和素-過氧化物酶-酶結(jié)合物，它將高度特異性地與生物s結(jié)合，并催化酶反應(yīng)，根據(jù)樣本中Vaspin水平的多少，定量地改變底物的顏色。

樣本

血清樣本可用于此測定法。

樣本儲存

建議將樣本儲存在-20°C的緊閉塑料管中。

樣本準(zhǔn)備

樣本必須用稀釋緩沖液（VP）稀釋。對于大多數(shù)測定（血清樣本，且不預(yù)期有j端值），使用1:4與稀釋緩沖液VP的稀釋比例應(yīng)該是合適的。根據(jù)預(yù)期的Vaspin水平，可以用VP進行更高或更低的稀釋。這個測試系統(tǒng)的z越線性允許樣本稀釋從1:2到1:32。人體來源的體液中的Vaspin濃度可能與血清或細胞培養(yǎng)上清w全不同。

稀釋建議方案：

在PE/PP管中移液210 ?l稀釋緩沖液VP（在大量系列中推薦使用多步移液器），加入70 ?l血清或血漿（稀釋1:4）。混合后，每次測定使用100 ?l此稀釋液。

技術(shù)建議

不能混合不同批號的試劑。如果儲存在2 – 8°C、未開封并避免陽光直射，所有試劑和微孔板都穩(wěn)定直至標(biāo)示的有效期。如果適當(dāng)使用，開封后組分的保質(zhì)期為4周。使用前將所有試劑置于室溫（20 - 25°C）。緩沖液中可能的沉淀在使用前必須通過混合和/或加熱溶解。室溫孵育意味著：20-25°C。

特異性：

通過兩種不同的方法研究了所用多克隆抗體的特異性。通過尺寸排除色譜法分離了原生血清樣本中的蛋白質(zhì)，得到的分數(shù)進行了a) ELISA檢測，以及b) ELISA陽性的分數(shù)也通過西方印跡法進行了測試。圖2顯示ELISA在大約37 kDa處檢測到一個信號，這一點通過西方印跡法得到了確認。理論上，Vaspin的分子量為45.2 kDa。與重組Vaspin相比，SEC峰分數(shù)的信號大小相同。計算出的分子量的差異可能是由于柱子校準(zhǔn)的可變性以及SEC條件的差異，如分數(shù)大小和流速造成的。

圖：Vaspin ELISA的特異性。將250?L人血清通過SEC Superdex 10/300GL進行分離，分數(shù)大小為0.5 ml，流速為0.5 ml/min。樣本用稀釋緩沖液稀釋至1:4。插圖顯示了西方印跡法的結(jié)果，樣本通過10% SDS-PAGE分離、轉(zhuǎn)移，并用生物s標(biāo)記的抗體（1:1000）和鏈霉親和素-過氧化物酶結(jié)合物（1:1500）染色。

文獻參考：

1. Korner, A. et al. Vaspin is related to gender, puberty and deteriorating insulin sensitivity inchildren, Int J Obes 35, 578–586 (2011).

2. Toulza, E. et al. Large-scale identification of human genes implicated in epidermal barrierfunction, Genome Biol 8, R107 (2007).

3. Jeong, E. et al. Circadian Rhythm of Serum Vaspin in Healthy Male Volunteers: Relationto Meals, Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 95, 1869–1875 (2010).

4. Loeffelholz, C. v. et al. Circulating vaspin is unrelated to insulin sensitivity in a cohort ofnondiabetic humans, European Journal of Endocrinology 162, 507–513 (2010).

5. Zhang, L. Li, L. Yang, M. Liu, H. & Yang, G. Elevated circulating vaspin levels weredecreased by rosiglitazone therapy in T2DM patients with poor glycemic control onmetformin alone, Cytokine (2011). 

ALPCO產(chǎn)品種類多樣，可測樣品來源包括人、大/小鼠、豚鼠、兔、豬、羊、狗、猴等，涉及神經(jīng)生物學(xué)、骨代謝、心血管疾病和氧化應(yīng)激、細胞因子與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、糖尿病和肥胖癥、內(nèi)分泌學(xué)、甲狀腺功能、腸胃病學(xué)、免疫學(xué)、生殖激素、抗體和抗原、分子診斷等多個研究領(lǐng)域，尤以糖尿病和肥胖癥研究領(lǐng)域見長。

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