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如何挑選合適細(xì)胞的血清
在培養(yǎng)細(xì)胞的過程中，你是否遇到：
本應(yīng)貼壁的細(xì)胞，某次傳代后出現(xiàn)不貼壁了？
細(xì)胞養(yǎng)不起來，生長速度緩慢，或突然停滯生長？
細(xì)胞狀態(tài)不好，視野中總是存在較多死細(xì)胞？
想要知道如何才能把細(xì)胞養(yǎng)好，我們需要先明確培養(yǎng)細(xì)胞的3個(gè)關(guān)鍵要素：良好的細(xì)胞來源，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)操作，正確的培養(yǎng)體系。關(guān)于操作，其中存在許多人為不可控因素，我們后期會另辟專題討論，今天重點(diǎn)聊下如何正確選擇合適的培養(yǎng)體系。
細(xì)胞的培養(yǎng)體系一般指用于培養(yǎng)細(xì)胞的*培養(yǎng)基，它在培養(yǎng)細(xì)胞過程中主要發(fā)揮4大功能：提供營養(yǎng)物質(zhì)、維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、提供物質(zhì)傳遞的介質(zhì)和指示細(xì)胞環(huán)境，同時(shí)也要保證培養(yǎng)基對所培養(yǎng)的細(xì)胞不會造成毒害或污染。通常情況下，細(xì)胞*培養(yǎng)基是由基礎(chǔ)培養(yǎng)基、細(xì)胞因子和血清所組成。
01 基礎(chǔ)培養(yǎng)基
目前市面上可選擇的基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類很多，如常用的DMEM（高糖/低糖）、培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的RPMI 1640等。這些基礎(chǔ)培養(yǎng)基可滿足大部分細(xì)胞培養(yǎng)的需求，但在培養(yǎng)某些較為特殊的細(xì)胞如干細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)的效果經(jīng)常不盡人意，這便需要對培養(yǎng)基的成分進(jìn)行個(gè)性化調(diào)整。
OriCell會通過平行試驗(yàn)，針對不同的細(xì)胞嘗試多種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分析并增減各培養(yǎng)基的成分，甚至將不同種類培養(yǎng)基按不同比例進(jìn)行調(diào)和等多種方式，甄選出細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
02 細(xì)胞因子
細(xì)胞因子則主要為白細(xì)胞介素類、生長因子類、腫瘤壞死因子等，發(fā)揮促進(jìn)增殖分化、調(diào)節(jié)免疫等作用。
03 胎牛血清
在細(xì)胞培養(yǎng)體系中，血清是不屬于人工合成的成分，同時(shí)也讓血清成分成為細(xì)胞培養(yǎng)體系中大的不確定因素，因此，如何選擇合適的血清是細(xì)胞培養(yǎng)得好壞的決定性因素之一。根據(jù)采血時(shí)機(jī)的不同，牛血清可分為胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS）、新生牛血清和小牛血清，我們細(xì)胞培養(yǎng)中一般使用的是胎牛血清。
胎牛血清是在母牛懷孕3-8個(gè)月時(shí)，通過胎牛心臟穿刺采血獲得新鮮的胎牛全血，經(jīng)自然層析、離心后收集得到去除血細(xì)胞、纖維蛋白等成分的淡黃色透明上清液體，并在生產(chǎn)過程使用多級高置流膜過濾技術(shù)和三級0.1µm終端微濾方法處理而獲取的血清。相比于新生牛和小牛血清，胎牛血清中所含的抗體、補(bǔ)體等對細(xì)胞有傷害的成分少，因此對于一些較“脆弱”的細(xì)胞如干細(xì)胞、原代細(xì)胞，一定要使用優(yōu)質(zhì)的胎牛血清進(jìn)行培養(yǎng)。
04 胎牛血清的功能
血清的成分十分復(fù)雜，既有協(xié)助物質(zhì)運(yùn)輸?shù)牡鞍?、營養(yǎng)物質(zhì)，還有促進(jìn)細(xì)胞生長的激素和因子等，正因?yàn)檠暹@種天然成分的復(fù)雜性，使得血清在細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)揮了多種功能：
? 提供維持細(xì)胞生長的激素，促進(jìn)所培養(yǎng)細(xì)胞的生長；
? 彌補(bǔ)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中沒有或含量很少的營養(yǎng)物質(zhì)；
? 提供結(jié)合蛋白，促進(jìn)細(xì)胞識別和利用維生素、脂類和其他激素等；
? 某些情況下結(jié)合蛋白質(zhì)能與有毒金屬和熱原質(zhì)結(jié)合，起到解毒作用；
? 促進(jìn)細(xì)胞貼壁，提供可促進(jìn)細(xì)胞鋪展在塑料培養(yǎng)基質(zhì)的因子；
? 起酸堿度緩沖液作用；
? 提供蛋白酶抑制劑，使細(xì)胞消化時(shí)殘留的胰蛋白酶失活，保護(hù)細(xì)胞不受傷害。
05 胎牛血清的使用
在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，胎牛血清的使用濃度一般在5%-10%，有特殊要求的濃度在20%。
血清對溫度比較敏感，不使用時(shí)必須保存在-20℃。解凍血清時(shí)要預(yù)防沉淀發(fā)生，不能直接將冷凍的血清放入37℃水浴或者溫箱中，因?yàn)檠逶谌诨瘯r(shí)，蛋白先融而冰塊后融，局部蛋白濃度過高易發(fā)生沉淀，影響血清質(zhì)量。
若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物，則可將血清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾，勿直接過濾血清，一般情況下不過濾也不會對效果造成影響。血清在解凍后，如果一次無法用完一瓶，可按 40～50mL分裝于無菌處理瓶中，再放入-20℃保存，避免反復(fù)凍融。
06 胎牛血清使用不當(dāng)?shù)娘L(fēng)險(xiǎn)
近年來疫情頻發(fā)，很多都是動物來源的病毒傳播，我國對于動物源制品的進(jìn)口一直有很嚴(yán)格的規(guī)定，而對于疫區(qū)來源的胎牛血清，同樣存在較大的生物學(xué)污染風(fēng)險(xiǎn)，比如病毒、支原體、噬菌體污染等。這對于使用血清進(jìn)行科研的實(shí)驗(yàn)操作人員造成了重大的潛在隱患，因此，國內(nèi)*對此也有明確的公告：未經(jīng)檢疫的胎牛血清可能攜帶傳染性物質(zhì)，一旦流入境內(nèi)，將會對人民群眾的生命健康造成重大威脅，如可能帶有瘋牛病病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛細(xì)小病毒、狂犬病毒或其他傳染性物質(zhì)，具有*的檢疫風(fēng)險(xiǎn)。
此外，不合格的血清對實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性、穩(wěn)定性和真實(shí)性也會造成嚴(yán)重影響。
1）無合格質(zhì)檢的胎牛血清存在支原體、病毒等污染，這對涉及細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果會造成不良影響；
2）采血工藝不規(guī)范導(dǎo)致溶血，溶血較嚴(yán)重的血清含有許多胞內(nèi)產(chǎn)物，對細(xì)胞有刺激作用，影響實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和數(shù)據(jù)的真實(shí)性；
3）血清批次不穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果難以重復(fù)。
07 如何選擇合適的胎牛血清
由于胎牛血清來源的特殊性，這使得選擇血清也成為了一門技術(shù)活。那么如何來甄別和選擇血清呢？
- 看產(chǎn)地
受供體飼養(yǎng)環(huán)境、生產(chǎn)工藝等因素的影響，原產(chǎn)澳洲、新西蘭的血清是目前品質(zhì)較高的血清來源。雖然北美洲的血清質(zhì)量也較高，但受疫情及國家進(jìn)口政策的限制，目前尚無正規(guī)渠道購買北美的血清產(chǎn)品。
- 看外觀
1）顏色：根據(jù)血紅蛋白含量的不同，胎牛血清可表現(xiàn)出黃色或紅色，實(shí)際上，血紅蛋白含量的高低對血清質(zhì)量并無直接影響，這個(gè)指標(biāo)的意義在于能體現(xiàn)出采血過程的嚴(yán)謹(jǐn)規(guī)范程度。胎牛血清或多或少總有點(diǎn)溶血，因?yàn)檎嬲奶ヅＱ迥δ懿?，紅細(xì)胞容易破裂。
2）澄清度：高質(zhì)量的胎牛血清由于蛋白和脂類等物質(zhì)含量低，表現(xiàn)為稀薄、清淡，而新生牛血清，相對而言更加粘稠，顏色略深。
3）血清沉淀：血清有沉淀，是質(zhì)量問題？血清中的沉淀是由纖維蛋白的凝聚產(chǎn)生，對血清質(zhì)量沒有任何影響，沉淀的產(chǎn)生原因很多，跟加工生產(chǎn)方式、是否反復(fù)凍融密切相關(guān)。雖然沉淀并不直接影響血清的質(zhì)量，但對細(xì)胞的顯微觀察有一定的阻礙。
- 看批間差異
采購血清要關(guān)注血清的批間差異。經(jīng)驗(yàn)豐富的供應(yīng)商會制定嚴(yán)謹(jǐn)?shù)馁|(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)，確保血清篩選標(biāo)準(zhǔn)的一致性，盡可能降低血清的批間差異，盡可能消除因采血、生產(chǎn)、貯藏工藝不同而造成的批間差異。
后，適合自己細(xì)胞生長的才是hao的。
08 胎牛血清有哪些重要的技術(shù)性指標(biāo)？
1）內(nèi)毒素：標(biāo)準(zhǔn)為不高于10EU/mL。內(nèi)毒素是細(xì)菌破碎后細(xì)胞壁的成分，因此內(nèi)毒素含量的高低可表現(xiàn)出采血到生產(chǎn)一系列過程中的無菌操作情況。
2）總蛋白含量：胎牛血清總蛋白含量一般范圍是30-50mg/mL，數(shù)值偏高，說明采血的牛齡偏大，不是胎牛，數(shù)值偏低，表明血清可能摻水了。
3）血紅蛋白：標(biāo)準(zhǔn)為不高于30mg/dl，顏色越紅，數(shù)值越高。
4）pH：7.0~8.0。
5）微生物：包括細(xì)菌、霉菌、支原體、噬菌體、各類病原性病毒等。
6）免疫球蛋白（IgG）：免疫球蛋白的數(shù)值能*體現(xiàn)出采血時(shí)的牛齡情況，新生牛的血清中容易產(chǎn)生IgM，IgG的含量也偏高，進(jìn)口胎牛血清不含IgM，另外IgG的含量也較低。