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外包服務(wù) real-time PCR,熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)步驟1、總RNA抽提(槍頭和離心管均經(jīng)過濕熱滅菌,無(wú)RNA酶)1)取勻漿器,加入1ml的Trizol Reagent,置冰上預(yù)冷。2)取100mg組織,加入到勻漿器中。3)充分研磨直至無(wú)可見組織塊。4)13000g離心10min取上清。5)加入250 μl,顛倒離心管15s,充分混勻,靜置3min。6)4℃下13000g離心8min。7)將上清轉(zhuǎn)移到一新的離心管中,加入0.8倍體積的異丙醇,顛倒混勻。8)-20℃放置15min。9)4℃下13000g離心10min,管底的白色沉淀即為RNA。10)吸除液體,加入75%乙醇1.5ml洗滌沉淀。11)4℃下13000g離心5min。12)將液體吸除干凈,將離心管置于超凈臺(tái)上吹3min。13)加入20μl無(wú)RNA酶的水溶解RNA。14)55℃孵育5min。2、反轉(zhuǎn)錄(槍頭和PCR均經(jīng)過濕熱滅菌,無(wú)RNA酶)1)取一PCR管,加入含2μg RNA的溶液。2)加入1μl oligo(dT)15。3)用無(wú)核糖核酸酶的去離子水補(bǔ)足至12μl。4)于PCR儀上70℃保溫5min,迅速置冰上冷卻。5)依次加入4μl 5×buffer,2μl 10mM dNTPs,1μl RNA inhibitor和1μl 反轉(zhuǎn)錄酶,用槍抽吸混勻。6)于PCR儀上42℃保溫60min,結(jié)束后80℃保溫5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。3、定量PCR1)取0.2ml PCR管,配制如下反應(yīng)體系,每個(gè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管。2× qPCR Mix 12.5μl7.5μM基因引物 2.0μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2.5μlddH2O 8.0μl2)取0.2ml PCR管,配制如下反應(yīng)體系,每個(gè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管。2×qPCR Mix 12.5μl7.5μM內(nèi)參引物 2.0μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2.5μlddH2O 8.0μl3)PCR擴(kuò)增預(yù)變性 95℃,10min循環(huán)(40次) 95℃,15s→60℃,60s溶解曲線 75℃→95℃,每20s升溫1℃4、結(jié)果處理ΔΔCT法:A=CT(目的基因,待測(cè)樣本)- CT(內(nèi)標(biāo)基因,待測(cè)樣本)B=CT(目的基因,對(duì)照樣本)- CT(內(nèi)標(biāo)基因,對(duì)照樣本)K=A-B表達(dá)倍數(shù)=2-K
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