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競爭法ELISA及其操作細節(jié)
閱讀：4714 發(fā)布時間：2021-9-8競爭法ELISA
“這個競爭法ELISA試劑盒總是做不好，數(shù)據(jù)好奇怪啊" 讓小編帶你走進競爭法ELISA的小世界，揭秘做好競爭法ELISA檢測的小技巧和小細節(jié)。
小概念：
直接競爭法：將捕獲抗體固化在微孔板上，加入酶標記抗原與待測樣本，若待測樣本中含有抗原，則與酶標記抗原競爭結(jié)合孔板上的捕獲抗體。
間接競爭法：將捕獲抗原固化在微孔板上，加入酶標記抗體與待測樣本，若待測樣本中含有抗原，則與孔板上的固化捕獲抗原競爭結(jié)合酶標記抗體。
競爭法ELISA檢測目標：
抗體、抗原、蛋白、代謝產(chǎn)物
試劑盒的關鍵：（以直接競爭法為例）
捕獲目的蛋白的抗體
使試劑顯色的酶標記抗原
ELISA孔板設計
ELISA孔板經(jīng)特殊設計，可以使各種蛋白及抗體高親和地附著在孔板內(nèi)。
競爭法ELISA是如何實現(xiàn)檢測的？
（以直接競爭法為例）
首先，微孔板預包被了捕獲抗體，并用BSA對微孔板進行封閉處理，這樣做的目的是避免非特異性結(jié)合的產(chǎn)生，降低背景信號，增加特異性。
將樣品與試劑盒中的酶標抗原充分預混合后，將混合物加入到微孔板中。酶標抗原與樣品中的目的蛋白可以和捕獲抗體上同一個表位競爭性結(jié)合。（*這一步不同于其他方法）
經(jīng)過抗原和抗體的充分結(jié)合后，樣品中的目的蛋白以及試劑盒的部分酶標抗原分別與固定在微孔板上的捕獲抗體結(jié)合，再通過清洗，洗滌走未結(jié)合的酶標抗原和其他非目的蛋白，最后通過TMB進行顯色。
當樣品目的蛋白含量遠遠大于酶標抗原含量時，最終結(jié)合在微孔板上的酶結(jié)合物相對較少，從而顯色信號弱（上圖左。）
當樣品目的蛋白含量遠遠小于酶標抗原含量時，最終結(jié)合在微孔板上的酶結(jié)合物相對較多，從而顯色信號強（上圖右。）
因此檢測蛋白的含量多少與最終檢測信號值的強弱成反比。
競爭法ELISA的小細節(jié)
上個板塊，小編帶你們回顧了下競爭法ELISA的基本檢測原理，可以看出保證混合物（樣品+酶結(jié)合蛋白）與捕獲蛋白的充分反應和結(jié)合是競爭法ELISA成功的關鍵。接下來，我們講一下實際操作中影響該環(huán)節(jié)的一些小細節(jié)。
實驗溫度
實驗溫度會影響微觀分子運動的速率以及活化分子比率。溫度越高，微觀分子運動增加，分子碰撞次數(shù)增加，活化分子比率增加。
同樣對于酶參與的催化反應，過高或過低溫度都會影響酶的活性，從而影響反應效率。
建議：參看產(chǎn)品使用說明，嚴格按照產(chǎn)品說明推薦溫度操作實驗。
振蕩器的選擇與參數(shù)設定
競爭法ELISA離不開振蕩器的使用。
為什么振蕩器對實驗如此重要呢？讓小編帶你走進微觀世界的ELISA檢測（如上圖）。
從微觀的角度上，固相與液相之間會形成一層具有邊界效應的界面，稱為邊界層，這個層面在一定程度上會影響抗原與抗體的充分結(jié)合。而振蕩器就能夠起到打破邊界層的阻礙效果，輔助抗原抗體更加充分結(jié)合。
通常情況下，大家常常關注到振蕩器的轉(zhuǎn)速，也就是500 rpm，然而另一個重要細節(jié)往往會被忽略——軌道直徑。
軌道直徑 ，又稱振幅，也就是托盤振蕩一圈時的直徑。根據(jù)天津阿斯爾生物科技有限公司的實驗經(jīng)驗，當振蕩器振速或振幅不足時，可能會造成整體OD值偏低的結(jié)果。當振幅過大時，可能會造成微孔板內(nèi)液體飛濺、樣品孔污染，進而影響實驗結(jié)果的準確性。
英國RSR開發(fā)總部使用的是德國IKA MTS 2/4振蕩器，如下圖所示。
該產(chǎn)品軌道直徑3mm，支持1-4個ELISA板同時振蕩，且能夠確保微孔板在振蕩時既不會松脫也不會有液體飛濺。
經(jīng)過RSR TJ的實驗驗證，美國精騏振蕩器HYQ-3111同樣滿足RSR旗下競爭法ELISA試劑盒的實驗需求。（轉(zhuǎn)速200~3000rpm，振幅4.5mm）。當您不確定實驗室的振蕩器是否滿足ELISA實驗規(guī)定時，可進行預實驗以確保得到穩(wěn)定重現(xiàn)性。
小小振蕩器，卻藏有這么多不可忽略的小細節(jié)，進而影響到最終實驗的成敗。因此當我們準備實驗的時候，認真遵循說明書，如果能對實驗的基本原理了解透徹，可以更加保證結(jié)果的準確。