微生物實驗用菌種的保存方法
圣賓儀器科技（上海）有限公司
微生物實驗用菌種是進行新產(chǎn)品研發(fā)和生產(chǎn)質(zhì)量控制的標準物質(zhì)。為了保證微生物實驗的準確靈敏和人員及環(huán)境的衛(wèi)生安全，特制定以下規(guī)定：
1. 菌種采集。實驗室用菌種一是到國家法定機構采購，二是購買ATCC菌種，三是科研中菌種交流。不管是哪種來源，均由公司統(tǒng)一采集。采集中嚴格按照規(guī)范執(zhí)行。要求包裝可靠，采集迅速，不泄漏不污染。保證菌種合格和環(huán)境安全。采集中要有菌種傳代標識。
2.菌種的活化：購買的標準菌種必須要求是凍干粉，科研中菌種交流可以為斜面或液體。
菌種的活化最好是在非選擇性瓊脂培養(yǎng)基上，除非特殊情況或特別推薦，一般不用液體培養(yǎng)基。具體使用培養(yǎng)基的情況如下表，詳細菌種使用方法見附表：
方法：①胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)，非選擇性羊血瓊脂，PCA或營養(yǎng)瓊脂，35℃正常環(huán)境培養(yǎng)24-48小時。②非選擇性羊血瓊脂，35℃正常環(huán)境培養(yǎng)24-48小時。③巧克力瓊脂平板，35℃5-10%CO2環(huán)境培養(yǎng)24-48小時。④ CDC厭氧血瓊脂35℃厭氧培養(yǎng)48-72小時；部分專性厭氧菌能需要5-7天，才能充分生長；對于梭菌，以下新鮮培養(yǎng)基也可選用：營養(yǎng)瓊脂，TSA瓊脂，PCA瓊脂，需培養(yǎng)48-96小時。⑤沙堡氏葡萄糖Emmons瓊脂25-28℃培養(yǎng)3-7天；也可用PDA瓊脂。⑥巧克力瓊脂平板，35℃微需氧環(huán)境培養(yǎng)48-72小時。⑦ 改良羅氏瓊脂或Middlebrook瓊脂，35℃5-10%CO2或正常環(huán)境培養(yǎng)7天。⑧ 緩沖活性碳酵母提取物瓊脂，35℃正常環(huán)境培養(yǎng)3-5天。⑨巧克力瓊脂平板，35℃5-10%CO2環(huán)境培養(yǎng)48小時。⑩ 先用腦心浸出液肉湯或TSB培養(yǎng)基35℃增菌培養(yǎng)18-24小時，再劃線至TSA瓊脂35℃正常環(huán)境培養(yǎng)24-48小時。11、先接種于MRS肉湯35℃增菌培養(yǎng)24-48小時，再劃線接種至含羊血的哥倫比亞CNA培養(yǎng)基35℃5%CO2環(huán)境培養(yǎng)24-48小時。12、 PDA瓊脂45℃正常環(huán)境培養(yǎng)48-72小時。13、 先接種于10B精氨酸肉湯，作系列梯度稀釋35℃正常培養(yǎng)至培養(yǎng)基變成粉紅色，接入A-8瓊脂。
3.菌種保存。所有菌種均由實驗室專人(雙人雙鎖)保存于專用冰箱或其它保存方式。要建立菌種登記臺帳，詳細記錄菌種采集、保管、制備、使用、處置情況；每一種菌種一定要有本公司的檢測鑒定報告（具體的的鑒定方法見ATCC提供的菌種證書方法）；具體菌種保存方法如下：
3.1 干粉菌種：購買的干粉菌種保存于2-8℃冰箱中，可保存3-5年。
3.2 斜面菌種或液體菌種：
3.2.1 液氮罐保存方法：用于第一代菌種的長期保存，每種菌種保存5管。
（1）準備用于液氮保藏的安瓿管或菌種保存管(塑料)，要求能耐受溫度突然變化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸鹽玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75×10mm的，或能容1．2mm液體的。
（2）加保護劑與滅菌保存細菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的細胞時，則將空安瓿管塞上棉塞， 121℃滅菌15分鐘：若作保存霉菌菌絲體用則需在安瓿管內(nèi)預先加入保護劑如10％的甘油蒸餾水溶液或10％二甲亞砜蒸餾水溶液，加入量以能浸沒以后加入的菌落圓塊為限，而后再用121℃滅菌15分鐘。
?。?）接入菌種：將菌種用10％的甘油蒸餾水溶液制成菌懸液，裝入已滅菌的安瓿管；霉菌菌絲體則可用滅菌打孔器，從平板內(nèi)切取菌落圓塊，放入含有保護劑的安瓿管內(nèi)，然后用火焰熔封。浸入水中檢查有無漏洞。
?。?）凍結再將已封口的安瓿管以每分鐘下降1℃的慢速凍結至-30℃。若細胞急劇冷凍，則在細胞內(nèi)會形成冰的結晶，因而降低存活率。
（5）保藏經(jīng)凍結至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷凍保藏器的小圓筒內(nèi)，然后再將小圓筒放入液氮保藏器內(nèi)。液氮保藏器內(nèi)的氣相為-150℃，液態(tài)氮內(nèi)為-196℃。
?。?）恢復培養(yǎng)保藏的菌種需要用時，將安瓿管取出，立即放入38-40℃的水浴中進行急劇解凍，直到全部融化為止。再打開安瓿管，將內(nèi)容物移入適宜的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
此法除適宜于一般微生物的保藏外，對一些用冷凍干燥法都難以保存的微生物如支原體、衣原體、氫細菌、難以形成孢子的霉菌、噬菌體及動物細胞均可長期保藏，而且性狀不變異。
3.2.2 液體石蠟保存法：將液體石蠟分裝于三角燒瓶內(nèi)，塞上棉塞，并用牛皮紙包扎， 121℃滅菌30分鐘，然后放在40℃溫箱中，使水汽蒸發(fā)掉，備用。將需要保藏的菌種，在最適宜的斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使得到健壯的菌體或孢子。用滅菌吸管吸取滅菌的液體石蠟，注入已長好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1cm為準，使菌種與空氣隔絕。將試管直立，置低溫或室溫下保存（有的微生物在室溫下比冰箱中保存的時間還要長）。
大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、假單胞桿菌屬、沙門氏菌屬、副傷寒沙門氏菌、李斯特氏菌屬、蠟樣芽胞桿菌、八疊球菌、短芽孢桿菌、大腸桿菌HB101、大腸桿菌DH5a、豬肺疫、禽多殺性巴氏桿菌（禽霍亂）、豬丹毒、大腸桿菌O157、大腸菌群、產(chǎn)氣腸桿菌、志賀氏菌屬；接種于半固體培養(yǎng)基上，36±1℃培養(yǎng)18-24小時，加入無菌石蠟油覆蓋，保存于2-8℃冰箱或室溫中?？杀４?-2年。注：副溶血性弧菌接種于含鹽的半固體培養(yǎng)基上，36±1℃培養(yǎng)18-24小時，加入無菌石蠟油覆蓋，保存于室溫
產(chǎn)氣莢膜梭菌、梭桿菌屬、擬桿菌屬等厭氧菌、厭氧消化鏈球菌：接種于CDC厭氧菌瓊脂中，培養(yǎng)18-24小時，加入無菌石蠟油覆蓋，保存于2-8℃冰箱或室溫中?？杀４?-2年。酵母菌：接種于YPD培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24-48小時，加入無菌石蠟油覆蓋，保存于2-8℃冰箱或室溫中。可保存1-2年。霉菌、白色念珠球菌：接種于PDA培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24-48小時，加入無菌石蠟油覆蓋，保存于2-8℃冰箱或室溫中?？杀４?-2年。鏈球菌屬：接種于羊血瓊脂，36±1℃培養(yǎng)24-48小時，加入無菌石蠟油覆蓋，保存于2-8℃冰箱或室溫中。可保存1-2年。副嗜血桿菌、淋病奈瑟菌(需5-10%CO2環(huán)境)、腦膜炎奈瑟菌(需5-10%CO2環(huán)境)、流感嗜血桿菌接種于巧克力瓊脂，36±1℃培養(yǎng)24-48小時，加入無菌石蠟油覆蓋，保存于2-8℃冰箱或室溫中?？杀４?-2年。分枝桿菌屬：接種于改良羅氏瓊脂或Middlebrook瓊脂36±1℃培養(yǎng)7天，加入無菌石蠟油覆蓋，保存于2-8℃冰箱或室溫中。可保存1-2年。
4.菌種制備。菌種制備按照批準的制備計劃執(zhí)行。制備中要按規(guī)范要求操作，同時做好工作記錄。記錄內(nèi)容包括：菌種名稱，傳代標識、制備數(shù)量。在制備容器上作出明確表示。具體菌種制備方法如下：可以麥氏比濁管計數(shù)每ml菌液的菌數(shù)
1）大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、假單胞桿菌屬、沙門氏菌屬、副傷寒沙門氏菌、李斯特氏菌屬、蠟樣芽胞桿菌、八疊球菌、短芽孢桿菌、大腸桿菌HB101、大腸桿菌DH5a、豬肺疫、禽多殺性巴氏桿菌（禽霍亂）、豬丹毒、大腸桿菌O157、大腸菌群、產(chǎn)氣腸桿菌、志賀氏菌屬；把各種細菌菌種劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，36±1℃培養(yǎng)18-24小時，挑取單菌落接種于10ml營養(yǎng)肉湯中，36±1℃培養(yǎng)18-24小時，計數(shù)出每ml營養(yǎng)肉湯中的細菌數(shù)。把菌液保存于2-8℃，此菌液可保存7-10天，每10天重新挑取單菌落接種于10ml營養(yǎng)肉湯中， 36±1℃培養(yǎng)18-24小時，用生理鹽水稀釋到10-7，計數(shù)出10-6/0.1ml、10-7/0.1ml營養(yǎng)肉湯中的細菌數(shù)。
2）產(chǎn)氣莢膜梭菌、梭桿菌屬、擬桿菌屬等厭氧菌、厭氧消化鏈球菌等厭氧菌直接接種于10ml液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基中，36±1℃培養(yǎng)18-24小時，計數(shù)出每ml液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基中的細菌數(shù)（在厭氧條件下培養(yǎng)）。
3）酵母菌、霉菌和白色念珠球菌：接種于PDA培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24-48小時，挑取單菌落接種于10ml葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24-48小時，用YPD瓊脂計數(shù)出每ml葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基中的菌落。把菌液保存于2-8℃，此菌液可保存7-10天，每10天重新挑取單菌落接種于10ml葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24-48小時，用生理鹽水稀釋到10-7，計數(shù)出10-6/0.1ml、10-7/0.1ml葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基中的菌數(shù)。
4）鏈球菌屬：接種于腦心浸液中36±1℃培養(yǎng)18-24小時，計數(shù)出每ml腦心浸液中的細菌數(shù)。把菌液保存于2-8℃，此菌液可保存7-10天，每10天重新挑取單菌落接種于10ml腦心浸液中， 36±1℃培養(yǎng)18-24小時，用生理鹽水稀釋到10-7，計數(shù)出10-6/0.1ml、10-7/0.1ml腦心浸液中的細菌數(shù)。
5）副嗜血桿菌、淋病奈瑟菌(需5-10%CO2環(huán)境)、腦膜炎奈瑟菌(需5-10%CO2環(huán)境)、流感嗜血桿菌接種于巧克力瓊脂，36±1℃培養(yǎng)18-24小時，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋，經(jīng)比濁后制成每1ml含菌數(shù)約相當于100～1000cfu的菌懸液。
6) 分枝桿菌屬：接種于改良羅氏瓊脂或Middlebrook瓊脂36±1℃培養(yǎng)7天，用0.9%無菌氯化鈉溶液將上述增菌培養(yǎng)后的質(zhì)控菌種的新鮮培養(yǎng)物制成1.0~3.0×103CFU/ml的菌懸液，作為工作菌液。
5．菌種的標識和使用期限：標識：菌種代數(shù)的計算為干粉菌種為第0代，轉接一次斜面加一代。具體標識為：例單增李斯特氏菌ATCC19114第0代，表識為單增李斯特氏菌ATCC19114-0，第一代表識為單增李斯特氏菌ATCC19114-1；第一代有12支，則表識為單增李斯特氏菌ATCC19114-1-1、……、單增李斯特氏菌ATCC19114-1-12；使用期限：傳代次數(shù)不得超過5代，菌種已變異或生化鑒定不符合；
6.菌種使用。菌種管理員，每月領取1支第一代(或第二代、第三代)菌種。再根據(jù)以上方法制備工作菌液，分發(fā)給實際使用者，實際使用者領用前應充分考慮重復實驗的需要。同一實驗要選擇同代菌種，保證實驗的可比性。領用菌種要詳細登記，領用人要簽字，并注明領用時間。
7.菌種處理。實驗完畢的菌種遺留物和污染物應嚴格按照三廢處理規(guī)定執(zhí)行。提供給外部的菌種必須經(jīng)公司總經(jīng)理批準，按規(guī)定要求包裝運輸。嚴禁私自對外提供菌種。
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