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微生物菌種是生物個(gè)體微生態(tài)系的成員，它們隨著生物個(gè)體生長發(fā)育而繁殖、演替，隨著個(gè)體組織生理變化而轉(zhuǎn)移、變遷。可見，內(nèi)生共生菌是植物益生菌的。這種菌株有四個(gè)特點(diǎn)：*，具有高度的安全性，目標(biāo)菌株是生物個(gè)體微生態(tài)系成員，因此．它不可能對生物個(gè)體產(chǎn)生污染、傷害；第二，目標(biāo)菌株是內(nèi)生共生菌，同生物個(gè)體親和力強(qiáng)，因此，目標(biāo)菌在生物個(gè)體內(nèi)易定植、易繁殖；第三，利用內(nèi)生共生菌可在生物體內(nèi)定植、繁殖、轉(zhuǎn)移的特性，以它為載體，將有效基因組建到內(nèi)生共生菌內(nèi)，構(gòu)建微生態(tài)工程菌；第四，內(nèi)生共生菌只在一定時(shí)間、一定空間起作用，而且不改變生物個(gè)體本身遺傳基因，因此，它是很安全的。

方法提要

收集樣本植株或各部位的組織沖洗24 h，嚴(yán)格進(jìn)行表面消毒，然后搗碎制成懸浮液，沉淀后取上清液，利用劃線或稀釋平板法接種于牛肉汁平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，選取芽孢桿菌代表性的單菌落進(jìn)行涂片、染色和鏡檢，選取單菌落移到斜面培養(yǎng)基上編號、培養(yǎng)，然后進(jìn)行室內(nèi)生物測定。選擇生物測定較佳的純菌株再進(jìn)行田間試驗(yàn)，選擇通過兩年田間試驗(yàn)或多點(diǎn)試驗(yàn)表現(xiàn)增產(chǎn)、防病等效果好并經(jīng)安全性檢查對人、畜及植物無害，對環(huán)境無污染的菌株，才可提供使用。

技術(shù)指標(biāo)

采集的樣本植株要在80℃水浴鍋內(nèi)加熱處理10～20 min，以殺死雜菌；分離得到的微生物菌種菌株，應(yīng)在28～35℃溫度下培養(yǎng)18～24 h，此為芽孢桿菌zui適宜生長的環(huán)境；將待生物測定的作物，包括種子、植株或塊(根)莖，置于含芽孢桿菌10CFU／mL濃度的懸浮液中浸泡1 h。

樣本的采集

(1)直接采樣方法要求取樣時(shí)應(yīng)注意以下3點(diǎn)：樣本植株應(yīng)與所選的益微將來要施用的作物相一致；要選擇在產(chǎn)量、品質(zhì)或各種抗逆性方面比同類植株有明顯優(yōu)勢的植株；選好樣品植株后，進(jìn)行編號、登記，立即分離或置于4℃條件下保存。

(2)間接采樣方法如采取樣本植株有困難，可選采集不同地區(qū)的土壤，在室內(nèi)種植作物，按直接采樣方法規(guī)定的原則采集樣本植株。

菌種分離

(1)分離取樣本植株的根、莖、葉、花和果實(shí)、種子或塊莖(根)組織沖洗24 h，嚴(yán)格進(jìn)行表面消毒，然后取組織10 g剪碎，放入裝有40 mL無菌水和10粒無菌玻璃球的三角瓶中，經(jīng)200～300 r／min振蕩10 min(如分離表皮以內(nèi)的細(xì)菌，則先經(jīng)0．5％漂白粉液表面消毒3～5 min，用無菌研缽研碎后，再振蕩)，靜置0．5 min，用滅菌吸管取5 mL上清液注入滅菌試管內(nèi)備用。

(2)培養(yǎng)  將盛有上清液的試管置于80℃的水浴鍋內(nèi)恒溫處理20 min，然后用滅菌移種環(huán)蘸取試管內(nèi)處理液，在蛋白胨培養(yǎng)基平板上劃線分離，28～35℃下培養(yǎng)24 h后再觀察。

(3)菌落挑選根據(jù)細(xì)菌在平板培養(yǎng)基上形成菌落的形態(tài)，如菌落大小、形狀為圓或不規(guī)則形，邊緣毛狀，菌苔厚或薄，起皺、光滑或粗糙，色澤透明或暗等不同特征，挑選不同類型的單菌落(如菌落不純應(yīng)進(jìn)行純化)，分別進(jìn)行涂片、芽孢染色法染色和鏡檢。通過鏡檢，凡芽孢染成綠色、菌體染成紅色的則可確定為芽孢桿菌。將微生物菌種的菌落編號并轉(zhuǎn)移到斜面培養(yǎng)基上，置28～35℃的溫箱中培養(yǎng)24h，取出放在冰箱保存，待生物測定。