詳細(xì)介紹
實(shí)時(shí)熒光定量PCR:
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限,實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度,并記錄在電腦軟件之中,通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此,實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的:
1)Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí),剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期(對(duì)數(shù)期),此時(shí)微小誤差尚未放大,因此Ct值的重現(xiàn)性,即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增,得到的Ct值是恒定的。
2)Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系,可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定,因此,實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確,重現(xiàn)性定量方法,已得到,廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究,藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。
操作流程
收集基因信息——>設(shè)計(jì)引物——>PCR ——>回收目的片段——>與載體連接,取得連接產(chǎn)物 ——> 用感受態(tài)細(xì)胞做轉(zhuǎn)化 ——>接菌——>陽(yáng)性克隆(酶切法或PCR)——>質(zhì)粒抽提——>質(zhì)粒測(cè)序——>測(cè)序結(jié)果分析——>克隆信息輸入數(shù)據(jù)庫(kù)——>質(zhì)粒實(shí)物保存。
產(chǎn)品名稱 | 分類 | 規(guī)格 |
海豚鏈球菌(StI)核酸檢測(cè)試劑盒 | PCR檢測(cè)試劑盒 | 50T |
下列相關(guān)產(chǎn)品:
小鼠細(xì)胞間粘附分子2(ICAM2)PCR檢測(cè)試劑盒 ,英文名: ICAM2
兔纖溶抑制因子/激活的纖溶抑制物(TAFI)ELISA檢測(cè)試劑盒RabbitThrombinactivatablefibrinolysisinhibitor,TAFIELISAKit 50T
牛血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3(VEGFR-3)免疫試劑盒 Bovine Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 3,VEGFR-3
英文名稱HumanANCAELISAKit人抗嗜中性粒細(xì)胞胞漿
PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:
方法
1:在冰浴中,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix (2mM)
4 μl 引物1(10pM)
2 μl 引物2(10pM)
2 μl Taq酶 (2U/μl)
1 μl DNA模板(50ng-1μg/μl)
1 μl 加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無(wú)熱蓋,不加或添加石蠟油。
2:調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執(zhí)行擴(kuò)增。一般:在93℃預(yù)變性3-5min,進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環(huán)30-35次,在72℃ 保7min。
3:伴放線放線桿菌探針?lè)晒舛?span>PCR試劑盒結(jié)束反應(yīng),PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4:PCR的電泳檢測(cè):如在反應(yīng)管中加有石蠟油,需用100μl進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
定量PCR方法:
a、競(jìng)爭(zhēng)法 產(chǎn)品僅用于科研實(shí)驗(yàn)
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中,待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增(其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記)。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段,而待測(cè)模板不被酶切,可通過(guò)電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開(kāi),分別測(cè)定熒光強(qiáng)度,根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。
b、內(nèi)參照法
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物,內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記,下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí),內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中,由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同,二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開(kāi)來(lái),分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度,以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。
c、PCR-ELISA法
利用di高辛等標(biāo)記引物,擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合,再加入抗di高辛酶標(biāo)抗體-辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物,最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR-ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn),若加入內(nèi)標(biāo),作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。
操作流程:
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL;
3.樣本孔中加入待測(cè)樣本50μL;空白孔不加。
4.除空白孔外,標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL,用封板膜封住反應(yīng)孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液(350μL),靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復(fù)洗板5次(也可用洗板機(jī)洗板)。
6.每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。
7.每孔加入終止液50μL,15min內(nèi),在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。
下列是公司正在銷售的產(chǎn)品:
大鼠末端補(bǔ)體復(fù)合體C5b-9(C5b-9)ELISA試劑盒 ,英文名: C5b-9 ELISA Kit
Monkey ierleukin 1 (IL-1) ELISA Kit白介素1(IL-1)ELISA試劑盒
RatComplemefragme4a,C4aELISAKit 大鼠過(guò)敏毒素/補(bǔ)體片斷4a(C4a)ELISA試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝
CLIAKitforA1cELISAKit大鼠糖化血紅蛋白A1c規(guī)格:48T/96T
細(xì)胞甘油-3-0酸脫氫酶(Glycerol-3-PhosphateDehydrogenase)總活性比色法定量檢測(cè)試劑盒20次
RatsolubleFactor-relatedApoptosis,sFAS/Apo-1ELISAKit大鼠可溶性凋亡相關(guān)因子(sFAS/Apo-1)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
小鼠0酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)(p-ERK)ELISA試劑盒 ,英文名: p-ERK ELISA Kit
大鼠血管舒緩激肽(BK)ELISA檢測(cè)試劑盒Ratbradykinin,BKELISAKit 96T/48T
人電子轉(zhuǎn)運(yùn)黃素蛋白-泛醌氧化還原酶/電子轉(zhuǎn)運(yùn)黃素蛋白脫氫酶(ETFDH)免疫試劑盒 Human ETFDH ELISA kit
RatNeuron-specificenolase,NSEELISAKit大鼠神經(jīng)特異性烯醇化酶(NSE)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
EDTA血液抗凝液100毫升
Mousepyridiniumcrosslink/PyriLinks,PYELISA試劑盒小鼠交聯(lián)物(PY)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
海豚鏈球菌(StI)核酸檢測(cè)試劑盒GLP-1R peptide 胰高血糖素樣肽-1受體多肽Multi-class antibodies規(guī)格: 0.5mg
KLK3 KLK3 / Kallikrein 3 兔單抗 (FITC) Human
Rhesus antibody Rh Phospho-Cyclin B1(Ser147) 0酸化周期素B1抗體 規(guī)格 0.1ml
顯影定影試劑A、B 各500ml 自產(chǎn)
ZDHHC-18 英文名稱: 鋅指蛋白Zdhhc18抗體 0.2ml
Phospho-CHK2 (ser516) 英文名稱: 0酸化細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)2抗體 0.1ml
KLK3 KLK3 / Kallikrein 3 兔單抗 (FITC) Human