收到細(xì)胞后，請按照以下方法進(jìn)行操作。

1. 取出25cm2培養(yǎng)瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置6-8小時(shí)或者過夜，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。

2. 待細(xì)胞達(dá)到80%匯合時(shí)準(zhǔn)備進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

3. 細(xì)胞傳代

1) 吸出25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞一次；

2) 添加0.125%胰蛋白酶消化液約1mL至培養(yǎng)瓶中，37℃溫浴3min左右；倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后吸棄消化液，再加入*培養(yǎng)液終止消化；

3) 用吸管輕輕吹打混勻，按1:2或1:3等適當(dāng)?shù)谋壤M(jìn)行接種傳代，然后補(bǔ)充新鮮的*培養(yǎng)基至5mL，放入37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4) 待細(xì)胞*貼壁后，培養(yǎng)觀察。之后每隔2-3天更換新鮮的*培養(yǎng)基。

產(chǎn)品名稱

名稱    小鼠卵巢顆粒細(xì)胞

2.組織來源：卵巢組織

3.產(chǎn)品規(guī)格：5×105cells/T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶

4.細(xì)胞簡介：

小鼠卵巢顆粒細(xì)胞分離自卵巢組織；卵巢是雌性動物的生殖器官，卵巢的功能是產(chǎn)生卵以及類固醇激素。卵巢的位置與睪丸相同，僅左側(cè)發(fā)育（右側(cè)已退化），呈葡萄狀，均為處于不同發(fā)育時(shí)期的卵泡，卵泡呈黃色，卵巢表面密布血管。卵巢的大小與年齡和產(chǎn)卵期有關(guān)。大多數(shù)脊椎動物有兩個(gè)卵巢，但是部分魚類的兩個(gè)卵巢融合為單個(gè)結(jié)構(gòu)，而所有鳥類只有左側(cè)卵巢有機(jī)能。卵巢是位于子宮兩側(cè)的一對卵圓形的生殖器官，它的外表有一層上皮組織，其下方有薄層的結(jié)締組織。卵巢的內(nèi)部結(jié)構(gòu)可分為皮質(zhì)和髓質(zhì)。皮質(zhì)位于卵巢的周圍部分，主要由卵泡和結(jié)締組織構(gòu)成；髓質(zhì)位于中央，由疏松結(jié)締組織構(gòu)成，其中有許多血管、淋巴管和神經(jīng)。卵巢顆粒細(xì)胞是卵巢的主要功能細(xì)胞，其增殖與分化直接影響著卵泡的生長啟動、發(fā)育、排卵、黃體形成以及甾體激素分泌等卵巢功能活動。卵巢顆粒細(xì)胞是卵泡內(nèi)的最大細(xì)胞群，也是主要的功能細(xì)胞，卵泡發(fā)育的顯著標(biāo)志之一就是顆粒細(xì)胞迅速生長及增殖，而成年動物的卵泡閉鎖主要是由顆粒細(xì)胞凋亡引起，尤其在卵泡發(fā)育后期，此外，顆粒細(xì)胞還與卵泡膜細(xì)胞共同完成卵巢激素的合成，維持著有利于卵母細(xì)胞生長和成熟的微環(huán)境。細(xì)胞形狀呈圓形或橢圓形。

5.方法簡介：

實(shí)驗(yàn)室分離的小鼠卵巢顆粒細(xì)胞采用先機(jī)械分離，而后膠原酶消化，最后差速貼壁法制備而來，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。

6.質(zhì)量檢測：

實(shí)驗(yàn)室分離的小鼠卵巢顆粒細(xì)胞經(jīng)FSHR免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

7.培養(yǎng)信息：

包被條件PLL（0.1mg/ml）

培養(yǎng)基含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

產(chǎn)品貨號CM-M050

換液頻率每2-3天換液一次

生長特性貼壁

細(xì)胞形態(tài)上皮細(xì)胞樣

傳代特性可傳1-2代

消化液0.25%胰蛋白酶

培養(yǎng)條件氣相：空氣，95%；CO2，5%

產(chǎn)品特點(diǎn):

1、 使用方便:不需昂貴設(shè)備。

2、 可以處理各種細(xì)菌菌體，包括新鮮菌液和冰凍菌體。

3、 將蛋白提取的時(shí)間縮短至30分鐘-1小時(shí)。

4、 采用溫和的中性裂解組分，保持蛋白活性。

5、 含蛋白穩(wěn)定劑，提取的蛋白穩(wěn)定。

6、 紫外檢測蛋白濃度時(shí)，背景干擾低。

7、 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨(dú)立的蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶等。

8、 本試劑盒中不有EDTA，與金屬螯和層析等兼容。

細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

一、凍存時(shí)的注意事項(xiàng)：

1. 在冷凍保存之前，應(yīng)觀察細(xì)胞生長是否良好(log phase) 且存活率高，凍存的細(xì)胞密度為80 – 90 ％最佳

2. 冷凍前檢測細(xì)胞是否保有其*性質(zhì)，例如是否有雜細(xì)胞或者支原體等。

3. 使用的DMSO 應(yīng)為試劑級等級，以5~10 ml 小體積分裝，4 度避光保存，勿作多次解凍。使用的甘油也應(yīng)為試劑級等級，以高壓蒸汽

滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用，因長期儲存后對細(xì)胞會有毒性。

4. 冷凍保存的細(xì)胞濃度：

4-1. 正常的成纖維細(xì)胞: 1-3x 10^6 cells/ml

4-2 雜交瘤細(xì)胞: 1~3 x 10^6 cells/ml，細(xì)胞濃度不要太高，某些雜交瘤會因冷凍濃度太高而在解凍24 小時(shí)后。

4-3.貼壁腫瘤細(xì)胞: 1 x 10^6，依細(xì)胞種類而異。腺癌類的細(xì)胞解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 10^6 cells/ml。

4-4. 懸浮細(xì)胞: 5~10 x 10^6 cells/ml, 而淋巴類細(xì)胞須至少5 x 10^6 cells/ml。

5. 冷凍保護(hù)劑濃度為5 %或10 ％ DMSO，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時(shí)，亦應(yīng)作一個(gè)backup culture，以防止冷凍失敗。