收到細胞后，請按照以下方法進行操作。

1. 取出25cm2培養(yǎng)瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中靜置6-8小時或者過夜，以穩(wěn)定細胞狀態(tài)。

2. 待細胞達到80%匯合時準備進行傳代培養(yǎng)。

3. 細胞傳代

1) 吸出25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞一次；

2) 添加0.125%胰蛋白酶消化液約1mL至培養(yǎng)瓶中，37℃溫浴3min左右；倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后吸棄消化液，再加入*培養(yǎng)液終止消化；

3) 用吸管輕輕吹打混勻，按1:2或1:3等適當?shù)谋壤M行接種傳代，然后補充新鮮的*培養(yǎng)基至5mL，放入37℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4) 待細胞*貼壁后，培養(yǎng)觀察。之后每隔2-3天更換新鮮的*培養(yǎng)基。

產(chǎn)品名稱

名稱    小鼠卵巢上皮細胞

2.組織來源：卵巢組織

3.產(chǎn)品規(guī)格：5×105cells/T25細胞培養(yǎng)瓶

4.細胞簡介：

小鼠卵巢上皮細胞分離自卵巢組織；卵巢是雌性動物的生殖器官，卵巢的功能是產(chǎn)生卵以及類固醇激素。卵巢的位置與睪丸相同，僅左側(cè)發(fā)育（右側(cè)已退化），呈葡萄狀，均為處于不同發(fā)育時期的卵泡，卵泡呈黃色，卵巢表面密布血管。卵巢的大小與年齡和產(chǎn)卵期有關。大多數(shù)脊椎動物有兩個卵巢，但是部分魚類的兩個卵巢融合為單個結(jié)構(gòu)，而所有鳥類只有左側(cè)卵巢有機能。卵巢是位于子宮兩側(cè)的一對卵圓形的生殖器官，它的外表有一層上皮組織，其下方有薄層的結(jié)締組織。卵巢的內(nèi)部結(jié)構(gòu)可分為皮質(zhì)和髓質(zhì)。皮質(zhì)位于卵巢的周圍部分，主要由卵泡和結(jié)締組織構(gòu)成；髓質(zhì)位于中央，由疏松結(jié)締組織構(gòu)成，其中有許多血管、淋巴管和神經(jīng)。卵巢上皮細胞主要功能：①上皮細胞能分泌激素，刺激卵細胞分化成熟；②細胞能分泌炎癥介質(zhì)，參與炎癥反應。

5.方法簡介：

實驗室分離的小鼠卵巢上皮細胞采用胰蛋白酶-膠原酶聯(lián)合消化法結(jié)合差速貼壁法，并通過上皮細胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

6.質(zhì)量檢測：

實驗室分離的小鼠卵巢上皮細胞經(jīng)Cytokeratin-19免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

7.培養(yǎng)信息：

包被條件鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培養(yǎng)基含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

產(chǎn)品貨號CM-M053

換液頻率每2-3天換液一次

生長特性貼壁

細胞形態(tài)上皮細胞樣

傳代特性可傳1-2代

消化液0.25%胰蛋白酶

培養(yǎng)條件氣相：空氣，95%；CO2，5%

產(chǎn)品特點:

1、 使用方便:不需昂貴設備。

2、 可以處理各種細菌菌體，包括新鮮菌液和冰凍菌體。

3、 將蛋白提取的時間縮短至30分鐘-1小時。

4、 采用溫和的中性裂解組分，保持蛋白活性。

5、 含蛋白穩(wěn)定劑，提取的蛋白穩(wěn)定。

6、 紫外檢測蛋白濃度時，背景干擾低。

7、 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨立的蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶等。

8、 本試劑盒中不有EDTA，與金屬螯和層析等兼容。

細胞處理：

1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

一、凍存時的注意事項：

1. 在冷凍保存之前，應觀察細胞生長是否良好(log phase) 且存活率高，凍存的細胞密度為80 – 90 ％最佳

2. 冷凍前檢測細胞是否保有其*性質(zhì)，例如是否有雜細胞或者支原體等。

3. 使用的DMSO 應為試劑級等級，以5~10 ml 小體積分裝，4 度避光保存，勿作多次解凍。使用的甘油也應為試劑級等級，以高壓蒸汽

滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用，因長期儲存后對細胞會有毒性。

4. 冷凍保存的細胞濃度：

4-1. 正常的成纖維細胞: 1-3x 10^6 cells/ml

4-2 雜交瘤細胞: 1~3 x 10^6 cells/ml，細胞濃度不要太高，某些雜交瘤會因冷凍濃度太高而在解凍24 小時后。

4-3.貼壁腫瘤細胞: 1 x 10^6，依細胞種類而異。腺癌類的細胞解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 10^6 cells/ml。

4-4. 懸浮細胞: 5~10 x 10^6 cells/ml, 而淋巴類細胞須至少5 x 10^6 cells/ml。

5. 冷凍保護劑濃度為5 %或10 ％ DMSO，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應作一個backup culture，以防止冷凍失敗。