收到細胞后，請按照以下方法進行操作。

1. 取出25cm2培養(yǎng)瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中靜置6-8小時或者過夜，以穩(wěn)定細胞狀態(tài)。

2. 待細胞達到80%匯合時準備進行傳代培養(yǎng)。

3. 細胞傳代

1) 吸出25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞一次；

2) 添加0.125%胰蛋白酶消化液約1mL至培養(yǎng)瓶中，37℃溫浴3min左右；倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后吸棄消化液，再加入*培養(yǎng)液終止消化；

3) 用吸管輕輕吹打混勻，按1:2或1:3等適當?shù)谋壤M行接種傳代，然后補充新鮮的*培養(yǎng)基至5mL，放入37℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4) 待細胞*貼壁后，培養(yǎng)觀察。之后每隔2-3天更換新鮮的*培養(yǎng)基。

產(chǎn)品名稱

名稱    大鼠心臟纖維原細胞

2.組織來源：心臟組織

3.產(chǎn)品規(guī)格：5×105cells/T25細胞培養(yǎng)瓶

4.細胞簡介：

大鼠心臟纖維原細胞分離自心臟組織；心臟由心肌細胞和非心肌細胞組成，非心肌細胞占細胞總數(shù)的70%，其中90%以上的非心肌細胞由心肌成纖維細胞組成。纖維細胞是機能不活躍的成纖維細胞。胞體呈梭形，胞質(zhì)較少，弱嗜酸性，胞核小，染色深。電鏡下可見，細胞中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體均不發(fā)達。當組織受損時，纖維細胞可轉(zhuǎn)化為成纖維細胞而參與修復(fù)過程。纖維細胞和成纖維細胞是處于不同功能狀態(tài)的同一種細胞，如在組織損傷后的修復(fù)過程中，纖維細胞可轉(zhuǎn)化為功能活躍的成纖維細胞。纖維細胞較小，呈多角形，胞質(zhì)較少，弱嗜酸性，胞核亦較小，染色較深，電鏡下粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較少，高爾基復(fù)合體不發(fā)達。成纖維細胞較大，呈星形或梭形，有突起，細胞核呈卵圓形，染色質(zhì)稀疏，染色淡，核仁明顯，胞質(zhì)較多。成纖維細胞能合成和分泌膠原蛋白、彈性蛋白和蛋白多糖，形成膠原纖維、彈性纖維和網(wǎng)狀纖維以及基質(zhì)成分。心肌成纖維細胞主要功能為對心肌細胞起結(jié)構(gòu)支持作用并負責細胞基質(zhì)外的合成，當心肌損傷時能產(chǎn)生旁分泌生長因子。心肌成纖維細胞是心臟結(jié)締組織中最常見的細胞，可合成和分泌膠原纖維、彈性纖維、網(wǎng)狀纖維及有機基質(zhì)，并且在外傷等因素刺激下，部分纖維細胞可重新轉(zhuǎn)變?yōu)橛字傻某衫w維細胞，其功能活動也得以恢復(fù)，參與組織損傷后的修復(fù)。因此，對心肌成纖維細胞的生理學研究成為現(xiàn)代心血管領(lǐng)域研究的一個重點。

5.方法簡介：

實驗室分離的大鼠心臟纖維原細胞采用膠原酶消化結(jié)合差速貼壁法制備而來制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

6.質(zhì)量檢測：

實驗室分離的大鼠心臟纖維原細胞經(jīng)Vimentin免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

7.培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

產(chǎn)品貨號CM-R190

換液頻率每2-3天換液一次

生長特性貼壁

細胞形態(tài)成纖維細胞樣

傳代特性可傳3代左右

消化液0.25%胰蛋白酶

培養(yǎng)條件氣相：空氣，95%；CO2，5%

產(chǎn)品特點:

1、 使用方便:不需昂貴設(shè)備。

2、 可以處理各種細菌菌體，包括新鮮菌液和冰凍菌體。

3、 將蛋白提取的時間縮短至30分鐘-1小時。

4、 采用溫和的中性裂解組分，保持蛋白活性。

5、 含蛋白穩(wěn)定劑，提取的蛋白穩(wěn)定。

6、 紫外檢測蛋白濃度時，背景干擾低。

7、 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨立的蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶等。

8、 本試劑盒中不有EDTA，與金屬螯和層析等兼容。

細胞處理：

1） 復(fù)蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

一、凍存時的注意事項：

1. 在冷凍保存之前，應(yīng)觀察細胞生長是否良好(log phase) 且存活率高，凍存的細胞密度為80 – 90 ％最佳

2. 冷凍前檢測細胞是否保有其*性質(zhì)，例如是否有雜細胞或者支原體等。

3. 使用的DMSO 應(yīng)為試劑級等級，以5~10 ml 小體積分裝，4 度避光保存，勿作多次解凍。使用的甘油也應(yīng)為試劑級等級，以高壓蒸汽

滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用，因長期儲存后對細胞會有毒性。

4. 冷凍保存的細胞濃度：

4-1. 正常的成纖維細胞: 1-3x 10^6 cells/ml

4-2 雜交瘤細胞: 1~3 x 10^6 cells/ml，細胞濃度不要太高，某些雜交瘤會因冷凍濃度太高而在解凍24 小時后。

4-3.貼壁腫瘤細胞: 1 x 10^6，依細胞種類而異。腺癌類的細胞解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 10^6 cells/ml。

4-4. 懸浮細胞: 5~10 x 10^6 cells/ml, 而淋巴類細胞須至少5 x 10^6 cells/ml。

5. 冷凍保護劑濃度為5 %或10 ％ DMSO，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應(yīng)作一個backup culture，以防止冷凍失敗。