作為常見(jiàn)實(shí)驗(yàn)技能之一的ELISA已經(jīng)成功逼瘋了一大批研究生：加樣加到手抽筋，拍板拍到人發(fā)瘋。為此，小愛(ài)嘔心瀝血寫(xiě)了一份ELISA實(shí)驗(yàn)詳解，原理、步驟、注意事項(xiàng)一網(wǎng)打盡，幫助各位小伙伴快速入門(mén)并精通ELISA（分為上下兩篇噢）。
ELISA實(shí)驗(yàn)原理
酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (Enzyme-linked Immunosorbent Assay，簡(jiǎn)稱(chēng)ELISA)， 是一種利用抗原抗體結(jié)合專(zhuān)一性進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測(cè)方法，是免疫學(xué)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法。ELISA可適用多種樣本類(lèi)型，主要包括血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)物上清液、細(xì)胞裂解物、唾液、組織裂解物和尿液等。
實(shí)驗(yàn)名稱(chēng) | WB | IHC/IF | ELISA |
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定性 | √ | √ | √ |
定量 | 半定量 | 半定量 | √ |
定位 |
| √ |
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靈敏度 | 中 | 中高 | 高 |
樣本類(lèi)型 | 組織 | 組織 | 血清 |
表1 ELISA與常規(guī)免疫實(shí)驗(yàn)對(duì)比
ELISA實(shí)驗(yàn)類(lèi)型
1）直接法ELISA：將抗原固定在微孔板上，使用酶標(biāo)抗體孵育抗原，最后加入酶反應(yīng)的底物進(jìn)行顯色反應(yīng)，顯色產(chǎn)生信號(hào)與所結(jié)合的分析物量成正比；
2）間接法ELISA：將抗原直接固定在微孔板上，首先將不帶有標(biāo)記的一抗加入微孔板，與板內(nèi)抗原特異性結(jié)合，接著加入酶標(biāo)二抗識(shí)別一抗，最后加入酶反應(yīng)的底物進(jìn)行顯色，顯色信號(hào)值與所結(jié)合的分析物量成正比；
3）夾心法ELISA：最常見(jiàn)的ELISA類(lèi)型。兩種特異性抗體將抗原夾在中間，通常稱(chēng)為配對(duì)的抗體對(duì)。將捕獲抗體包被在微孔板上，加入樣品后，捕獲抗體與樣本結(jié)合，然后再加入酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體，形成夾心抗體對(duì)，最后加入酶反應(yīng)的底物進(jìn)行顯色反應(yīng)，顯色產(chǎn)生信號(hào)值與所結(jié)合的分析物量成正比。夾心法ELISA使用兩種抗體與抗原結(jié)合，因此特異性更高；
4）競(jìng)爭(zhēng)法：將捕獲抗體包被在微孔板上，加入標(biāo)記的抗原，該抗原可與樣本中的目標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合捕獲抗體，樣品中存在的抗原越多，能夠與捕獲抗體結(jié)合的標(biāo)記抗原就越少，加入底物并產(chǎn)生信號(hào)，信號(hào)值與樣品中存在的蛋白量成反比。
ELISA類(lèi)型 | 優(yōu)點(diǎn) | 缺點(diǎn) | 適用場(chǎng)景 |
直接法ELISA | 操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)耗時(shí)短 | a)僅使用一種抗體，所以特異性不夠高 b)如果來(lái)自樣本的所有蛋白質(zhì)都被固定在孔中，則有可能出現(xiàn)高背景 | 評(píng)估抗體的親和力和特異性及研究阻斷/抑制相互作用 |
間接法ELISA | 利用二抗進(jìn)行信號(hào)放大 | 二抗可能引起交叉反應(yīng) | 測(cè)定內(nèi)源性抗體 |
夾心法ELISA | a)高特異性和高靈敏度 b)與復(fù)雜的樣品基質(zhì)兼容 | a)實(shí)驗(yàn)流程較長(zhǎng) b)配對(duì)抗體對(duì)的開(kāi)發(fā)具有挑戰(zhàn)性 | 確定生物樣本中的分析物濃度 |
競(jìng)爭(zhēng)法ELISA | 能夠定量小分子 | a)僅使用一種抗體，特異性不高 b)需要標(biāo)記抗原 | 確定小分子和激素的濃度 |
表2 四種ELISA類(lèi)型的比較
如何選擇合適的ELISA試劑盒
小伙伴們?cè)诹私饬薊LISA的原理和類(lèi)型之后，是不是迫不及待要開(kāi)始大展身手了，NO！最重要的ELISA試劑盒，我們還沒(méi)好好選一選呢。俗話(huà)說(shuō)，兵馬未動(dòng)，糧草先行，選擇一個(gè)有質(zhì)量有保障并且適合自己實(shí)驗(yàn)的ELISA試劑盒，才能夠保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。ELISA試劑盒的選擇和抗體的選擇一樣，我們都要考慮很多因素，包括以下方面：
1）樣本種屬：一般情況，不同種屬不能通用。小鼠、人或者其他家禽的因子檢測(cè)要選擇對(duì)應(yīng)種屬的試劑盒。
2）待測(cè)因子表達(dá)水平：待測(cè)因子表達(dá)水平?jīng)Q定著我們要選擇的試劑盒的檢測(cè)限和靈敏度。
3）樣本類(lèi)型：ELISA實(shí)驗(yàn)可以檢測(cè)的樣本類(lèi)型包括：血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清、尿液等，不同的試劑盒適配的樣本類(lèi)型不同。并且不同的樣本，預(yù)處理也會(huì)有所不同。
4）文獻(xiàn)支持：相同的種屬，指標(biāo)、靈敏度，當(dāng)然會(huì)選擇發(fā)表高分文獻(xiàn)多的那一個(gè)啦。
5） 試劑盒類(lèi)型：ELISA的試劑盒有即用型和研發(fā)型兩種，即用型里面包括實(shí)驗(yàn)所需的所有試劑，適合新手；研發(fā)型試劑盒需要自己包被微孔板，勝在經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，適合ELISA已經(jīng)做得爐火純青的熟手。
6）儀器設(shè)備：ELISA 檢測(cè)方法有很多，但在實(shí)驗(yàn)室中較普遍的方法是比色、熒光和化學(xué)發(fā)光法，其中比色法又是最常見(jiàn)的，每個(gè)孔中的顯色量用分光光度計(jì)讀取，樣品在彼此之間進(jìn)行比較，或與用已知分析物濃度制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行比較。也就是說(shuō)，ELISA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果需要用酶標(biāo)儀在對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度，一般也會(huì)使用雙波長(zhǎng)測(cè)定（檢測(cè)波長(zhǎng)和校正波長(zhǎng)），所以酶標(biāo)儀需要能夠設(shè)置到我們使用的兩個(gè)波長(zhǎng)。
小愛(ài)在這里也給大家推薦兩個(gè)品牌的ELISA試劑盒，bio-techne旗下的R&D systems作為ELISA的金標(biāo)準(zhǔn)，一直致力于開(kāi)發(fā)包括細(xì)胞因子、ELISA試劑盒、抗體、Luminex液相芯片、多因子檢測(cè)固相芯片在內(nèi)的免疫學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)產(chǎn)品，可提供即用型和研發(fā)型兩種ELISA試劑盒。Absin，中國(guó)人自己的生命科學(xué)百寶箱，也能夠提供即用型的ELISA試劑盒，包含一整套完整的試劑，國(guó)產(chǎn)的價(jià)格，進(jìn)口的品質(zhì)。
文中相關(guān)產(chǎn)品：
產(chǎn)品名稱(chēng) | 貨號(hào) | 檢測(cè)范圍 |
Human IL-6 ELISA Kit | abs510003-96T | 9.38pg/mL-600pg/mL |
Human IL-6 ELISA Kit (Plus) | abs551103-96T | 1.56-100pg/ml |
Human IL-6 High Sensitivity ELISA Kit | abs551804-96T | 0.31-20 pg/mL |
Absin產(chǎn)品線(xiàn)：
爆款產(chǎn)品：試劑盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化檢測(cè)、殘留檢測(cè)、多因子檢測(cè))；細(xì)胞培養(yǎng)(類(lèi)器官試劑盒+基質(zhì)膠，胎牛血清+培養(yǎng)添加劑+細(xì)胞因子)、分化試劑盒；分子(mRNA合成服務(wù)+提取試劑盒)；化合物大包裝；輔助試劑、耗材/儀器、定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...
特色產(chǎn)品：雞胚提取物CEE、B27、N2、霍亂毒素B亞單位CTB、牛腦垂體提取物BPE、百日咳毒素PTX、重組人胰島素Insulin、人源低密度脂蛋白LDL...
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