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檢測原理：

細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，會(huì)激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會(huì)切斷核小體間的基因組DNA，產(chǎn)生180bp-200bp的DNA片段?；蚪MDNA雙鏈或單鏈斷裂時(shí)會(huì)出現(xiàn)產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶 (TdT) 的催化作用下，與熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端，從而通過光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀直接進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法 (Terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL) 。

圖1 TUNEL試劑盒原理示意圖

應(yīng)用范圍：

可用于檢測冷凍或石蠟切片中的細(xì)胞凋亡情況，也可檢測培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞的凋亡情況?？蛇x擇性的檢測凋亡細(xì)胞，而非壞死細(xì)胞或因輻照和藥物治療而造成的DNA鏈斷裂的細(xì)胞。

產(chǎn)品優(yōu)勢：

1、應(yīng)用范圍廣：可用于貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞、冷凍切片、石蠟切片；

2、靈敏度高：可以對完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色；

3、簡單快速：僅需1.5-3h即可完成；

4、信噪比高：背景染色極低，陽性染色明亮；

5、檢測方法多樣：熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀、光學(xué)顯微鏡。

選擇指南：

圖2  TUNEL試劑盒選擇指南

常見問題解答：

1、紅色熒光和綠色熒光的試劑盒與生物素標(biāo)記的試劑盒有何不同？

最大的區(qū)別在于適配的儀器不同，生物素標(biāo)記的試劑盒適配光學(xué)顯微鏡，所以在細(xì)胞核染色時(shí)生物素標(biāo)記的試劑盒一般適配蘇木素或者甲基綠，熒光素標(biāo)記的試劑盒一般適配DAPI ，但是熒光素標(biāo)記的試劑盒實(shí)驗(yàn)時(shí)間、短操作簡便、結(jié)果易觀察。

圖3 TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒（綠色熒光）

2、陽性對照和陰性對照的作用？

陽性組對照用來驗(yàn)證本次實(shí)驗(yàn)操作和試劑盒有無問題，陰性組對照為了排除細(xì)胞自身凋亡、操作過程、或者染料等原因?qū)е碌姆翘禺愋匀旧灿糜谡{(diào)整拍攝曝光強(qiáng)度。一般情況下只需一個(gè)陽性對照和一個(gè)陰性對照，多個(gè)組織也可以設(shè)立多個(gè)陰性對照。

3、非特異標(biāo)記（假陽性）？

1）細(xì)胞或組織的核酸酶或聚合酶活性水平較高（如平滑?。?，DNA被切斷，易導(dǎo)致假陽性。建議：取出細(xì)胞或組織后要立即并充分固定，阻止這些酶的活性，設(shè)置陰性對照有助于判斷；
2）內(nèi)源性過氧化物酶影響，建議：對于肝臟、腎臟等血細(xì)胞含量多的組織，適當(dāng)延長封閉時(shí)間和升高過氧化氫的濃度；
3）固定液濃度過高或過低，導(dǎo)致組織中心部分固定效果不佳，而使得中心部細(xì)胞自溶、DNA鏈出現(xiàn)不規(guī)則斷裂，產(chǎn)生假陽性。建議：推薦使用4%多聚甲醛；
4）TdT酶反應(yīng)時(shí)間過長或Tunel反應(yīng)過程中反應(yīng)液發(fā)生蒸發(fā)或滲漏，細(xì)胞或組織表面不能保持濕潤。建議：注意控制反應(yīng)時(shí)間，并確保TdT酶反應(yīng)液能覆蓋樣品；
5）石蠟、脂肪、血液、體液等都較易與染料結(jié)合，所以組織切片制作時(shí)要保持干凈、脫蠟要干凈；
6）有些試劑或細(xì)胞存在自發(fā)熒光，選擇染料時(shí)要避開自發(fā)熒光的顏色。

4、沒有染上熒光？

1）固定不充分。固定液選擇4%多聚甲醛，現(xiàn)用現(xiàn)配。不建議使用乙醇，乙醇固定液對組織的滲透力較弱，影響TUNEL標(biāo)記效率；
2）細(xì)胞膜和核膜的通透不充分，TdT酶未能到達(dá)核內(nèi)。細(xì)胞與冰凍切片，可用2% Triton X-100溶液通透5-30min，石蠟切片推薦使用蛋白酶K，37℃通透30 min；不同的細(xì)胞和組織所需要的通透時(shí)間略有不同，時(shí)間太長容易脫片，適當(dāng)調(diào)整；
3）延長標(biāo)記時(shí)間至2h，并適當(dāng)增加TdT酶及dUTP的用量；
4）確定實(shí)驗(yàn)對象細(xì)胞有凋亡。準(zhǔn)備一份DNase I處理的陽性對照，驗(yàn)證TdT酶反應(yīng)是否正確進(jìn)行。

圖4 TUNEL及HE染色圖

5、熒光背景高？

1）支原體污染：可以使用支原體染色檢測試劑盒驗(yàn)證；

2）TdT酶反應(yīng)時(shí)間過長，可以用試劑盒提供的TdT酶稀釋液將TdT酶稀釋2-5倍后再按照說明書操作，稀釋后的TdT酶僅供當(dāng)日使用；

3）DAB孵育時(shí)間過長，減少DAB染色時(shí)間；

4）處于高速分裂和增殖狀態(tài)中的細(xì)胞，有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞核中的DNA 斷裂。建議：在非高增殖期取樣檢測；

5）有些試劑或細(xì)胞存在自發(fā)熒光，選擇染料時(shí)要避開自發(fā)熒光的顏色；

6）Biotin-X-dUTP的非特異性結(jié)合，在TdT酶反應(yīng)之后，再用含0.1% Triton X-100和1mg/mL BSA的PBS洗三次。

6、標(biāo)記率低？

1）乙醇、甲醇或甲醛（市面上購買的甲醛大多含有甲醇）固定的樣品標(biāo)記效率較低（因?yàn)樵诠潭〞r(shí)染色質(zhì)未能與蛋白質(zhì)交聯(lián)，而在操作中丟失），采用推薦的固定液；
2）固定時(shí)間過長，導(dǎo)致交聯(lián)程度過高，減少固定時(shí)間；
3）貼壁細(xì)胞如果使用藥物誘導(dǎo)凋亡，會(huì)細(xì)胞皺縮，貼壁黏附力降低，導(dǎo)致凋亡細(xì)胞容易脫落。建議：請注意操作輕緩，防止發(fā)生凋亡的細(xì)胞在洗滌時(shí)被洗去。后續(xù)整個(gè)操作也需要輕緩。

注：文中圖片來自網(wǎng)絡(luò)或參考文獻(xiàn)，僅供學(xué)習(xí)參考用

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