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NK細(xì)胞概述：

自然殺傷（nature killer，NK）細(xì)胞屬于天然淋巴樣細(xì)胞家族，在人類中通常被定義為CD3^- CD56⁺細(xì)胞，占循環(huán)淋巴細(xì)胞的5%～15%。NK細(xì)胞是抵御病毒感染和細(xì)胞突變的第一道防線，無需預(yù)先致敏就能殺死威脅宿主的癌細(xì)胞、異體細(xì)胞和外來病原體感染的細(xì)胞，被認(rèn)為是癌癥免疫監(jiān)測、移植排斥和早期病毒免疫的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞。

圖 NK細(xì)胞（黃）和癌細(xì)胞（紅）

NK細(xì)胞免疫療法：

CAT免疫療法的成功激發(fā)了研究者們利用其他免疫細(xì)胞進(jìn)行癌癥治療的興趣，簡單的說細(xì)胞免疫療法就是采集人體自身免疫細(xì)胞，經(jīng)過體外培養(yǎng)，使其數(shù)量倍增，然后再回輸?shù)饺梭w，一方面用來消除癌細(xì)胞、突變細(xì)胞，另一方面激活和增強(qiáng)機(jī)體免疫力，控制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。與CAT-T療法相比，NK療法可以靶向多種致病性抗原，具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性，且不分泌引發(fā)細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）的主要細(xì)胞因子，可以極大地減輕不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，被寄予厚望。

NK細(xì)胞治療的主要策略：

體外活化的自體或異體NK細(xì)胞、NK細(xì)胞和單抗藥（如免疫檢查點(diǎn)抑制劑）聯(lián)合來誘導(dǎo)抗體特異的細(xì)胞毒性（如：抗EGFR的西妥昔單抗）、CAR-NK細(xì)胞免疫療法等等。

目前尚未有NK細(xì)胞療法上市，但其臨床試驗(yàn)如火如荼，截止11月份clinicaltrials網(wǎng)站上，關(guān)于“NK Cell"的搜索結(jié)果已高達(dá)720例，目前在NK細(xì)胞療法在已經(jīng)在急性髓細(xì)胞白血病、慢性髓性白血病、骨髓增生異常綜合征、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、以及胃癌、肝癌、肺癌、腸癌等實(shí)體瘤的治療中表現(xiàn)出良好的治療效果。

圖 clinicaltrials中“NK Cell"的搜索結(jié)果

體外擴(kuò)增的NK細(xì)胞來源：

NK細(xì)胞除了從自體或異體的外周血分離獲得，還可以來源于臍帶血、干細(xì)胞分化等，此外，由于以上三種方式獲得細(xì)胞的繁瑣，在CAT-NK的研究中，不少研究者使用NK-92進(jìn)行進(jìn)一步的修飾，臨床前研究已經(jīng)取得了較好結(jié)果，值得注意的是，需要在輸注前對細(xì)胞進(jìn)行輻射。

人外周血NK細(xì)胞的分離純化方案：

準(zhǔn)備：15mL離心管（abs7102）或錐形管、Hank's液（abs9257）或PBS（abs962）、人淋巴細(xì)胞分離液（abs930）。

圖 愛必信人淋巴細(xì)胞分離液（abs930）

1、獲取PBMC

1）準(zhǔn)備無菌的15mL離心管或錐形管；
2）加入淋巴細(xì)胞分離液5mL；（注意：淋巴細(xì)胞分離液使用前需恢復(fù)室溫，18-25℃）
3）Hank's液（abs9257）或PBS（abs962）緩沖液1:1比例（如果全血樣本粘稠，可適當(dāng)增大比例）稀釋抗凝過的全血樣品；
4）小心沿著壁管，接近分離液層面，非常緩慢地加入新鮮的稀釋過的4mL全血樣品在淋巴細(xì)胞分離液上面；（注意：切記不要攪渾淋巴細(xì)胞分離液）
5）小心放進(jìn)離心機(jī)（水平轉(zhuǎn)子），4℃離心20-30min，速度為400g-1000g；（注意：離心機(jī)剎車應(yīng)取消，需等待自然停止）
6）小心取出離管，切記不要震動；
7）可見上層為淡紅色透明血漿，其次為薄薄的致密白色環(huán)，為PBMC；
8）吸棄上清后，將白膜層輕輕地吸出來轉(zhuǎn)移到新的離心管中；
9）用PBS重懸，室溫，300g離心10min，重復(fù)操作2次，棄去上清，用少量PBS重懸。

2、NK細(xì)胞的純化

NK細(xì)胞純化常用的方式是磁珠分選，包括陽性分選和陰性分選兩種，人NK細(xì)胞發(fā)育階段主要基于CD34、CD117、CD56和CD94的表達(dá)水平。CD56表達(dá)增加是NK成熟的關(guān)鍵，CD56+和CD16+可以鑒別和分離不受其他淋巴細(xì)胞污染的NK細(xì)胞。此外，白細(xì)胞介素2/15受體β（CD122）也是NK細(xì)胞發(fā)育后期的重要標(biāo)志。

3、NK細(xì)胞培養(yǎng)

1）將純化后的NK細(xì)胞用免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基（abs9772）重懸，按照一定密度接種于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中。

2）在免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基中添加100-200IU/mL的IL-2，確保NK細(xì)胞的增值和活化并有助于提高細(xì)胞毒性，與IL-15聯(lián)合應(yīng)用可促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖，有利于NK細(xì)胞的激活。 

3）將細(xì)胞置于37℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)至少48h，再進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞功能鑒定等實(shí)驗(yàn)。

名詞通解：

陽性篩選：磁珠結(jié)合需要篩選細(xì)胞的表面標(biāo)志物，達(dá)到純化目的。

陰形篩選：通過磁珠結(jié)合等手段除去混合物細(xì)胞中除目的細(xì)胞之外的其他細(xì)胞，以達(dá)到純化目的。

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[1] 米錦濤;袁成良.NK細(xì)胞相關(guān)免疫檢查點(diǎn)及其抑制劑的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2023,31(24):4645-4650.
[2] Shimasaki N, Jain A, Campana D. NK cells for cancer immunotherapy[J]. Nature reviews Drug discovery, 2020, 19(3): 200-218.

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