流行性肥胖是近幾年的一大健康挑戰(zhàn)，肥胖促使一些心血管疾病如高血壓、血栓等發(fā)病率增高，糖尿病則是以高血糖為特征的代謝性疾病，長期存在可導(dǎo)致各種組織，特別是眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害、功能障礙。3T3-L1細(xì)胞——小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（前脂肪細(xì)胞）系具有向脂肪細(xì)胞分化的特性，被廣泛用于研究糖尿病，肥胖癥等。
圖1 3T3-L1細(xì)胞形態(tài)
表1 3T3-L1基礎(chǔ)培養(yǎng)信息
細(xì)胞名稱 | 3T3-L1（小鼠胚胎成纖維細(xì)胞） |
來源 | 18 天左右胎齡的 Swiss 小鼠胚胎 |
生長方式 | 貼壁生長 |
細(xì)胞形態(tài) | 成纖維細(xì)胞樣 |
培養(yǎng)條件 | 95%空氣、5%CO2、37℃ |
推薦營養(yǎng)體系 | DMEM(abs9483)+10% NBCS(abs978)+1%P/S(abs9244) |
傳代 | 0.25%Try(abs47014937)消化5-15min 1:3-1:4傳代 |
凍存液配制 | 培養(yǎng)基+5%DMSO(abs9187) |
培養(yǎng)小提示：
1）"Never allow culture to become completely confluent"。細(xì)胞匯合度達(dá)到70-80%時進(jìn)行傳代；
2）為了避免細(xì)胞聚團(tuán)，在等待細(xì)胞消化的過程中，不要通過擊打或搖晃瓶子來刺激細(xì)胞。難以消化的細(xì)胞可以放置在37℃；
3）正常培養(yǎng)（非脂肪誘導(dǎo)期）出現(xiàn)空泡時，請優(yōu)先考慮環(huán)境壓力。造成壓力的原因包括培養(yǎng)基中缺乏谷氨酰胺、添加抗真菌藥物、培養(yǎng)基中二氧化碳、碳酸氫鈉濃度不當(dāng)或培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)耗盡；
4）使用胎牛血清可能會造成細(xì)胞分化?。?！
3T3-L1成脂誘導(dǎo)“雞尾酒"策略
圖2 3T3-L1細(xì)胞（正常）和3T3-L1成脂分化后（對照）
一般認(rèn)為，細(xì)胞的增值和分化呈負(fù)相關(guān)，細(xì)胞開啟分化必先退出分裂增值周期，常用的方法就是讓其生長至融合期，出現(xiàn)接觸抑制。脂肪生成是一個將碳水化合物和其他底物轉(zhuǎn)化為脂肪酸，然后作為TAGs（甘油三酯）儲存起來的過程。
經(jīng)典“雞尾酒"法中，胰島素樣生長因子(IGF-1)激活有絲分裂原蛋白激酶途徑誘導(dǎo)細(xì)胞分化、cAMP磷酸二酯酶抑制劑(IBMX)通過激活cAMP依賴性蛋白激酶途徑增強(qiáng)CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白家族(C/EBPs)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ) 表達(dá)促進(jìn)成脂分化、地塞米松促進(jìn)C/EBPs的表達(dá)。
3T3-L1經(jīng)典成脂誘導(dǎo)過程
誘導(dǎo)步驟：將融合后的3T3-L1（匯合度100%）細(xì)胞從DMEM生長培養(yǎng)基切換到含有0.5mmol/L IBMX(abs817348)、10mg/mL胰島素和1μmol/L地塞米松的分化培養(yǎng)基中48h。然后將細(xì)胞維持在含有10%FBS和10 mg/mL胰島素的DMEM培養(yǎng)基中48h，之后每隔一天更換常規(guī)新鮮培養(yǎng)基，一般第九天染色。
PS：不同產(chǎn)品活性純度不同，濃度僅供參考，不同誘導(dǎo)方案略有差異，IBMX(abs817348)用DMSO溶解時需要超聲破碎。
染色：油紅O儲存液與超純水按3:2稀釋混勻，過濾，避光靜置后酒紅色且無沉淀，現(xiàn)配現(xiàn)用，2h內(nèi)用完。
用PBS磷酸緩沖液小心漂洗細(xì)胞三次，以2mL/孔（六孔板）的劑量加入4%多聚甲醛，室溫固定40min，再用蒸餾水漂洗2次，每孔加入油紅O工作液1mL，常溫染色15min，蒸餾水漂洗至無殘?jiān)麴s水漂洗后加入PBS鏡下觀察。
PS：清洗細(xì)胞時動搖要輕柔，防止脂滴脫落，油紅O工作液一定要過濾至無沉淀，否則染色后有殘?jiān)逸^難沖洗！??！
“雞尾酒"誘導(dǎo)策略進(jìn)擊版
有研究者探索了葡萄糖濃度和誘導(dǎo)液2（含10mg/mL胰島素的低糖培養(yǎng)基）的作用時間對3T3L1細(xì)胞成脂分化率的影響，結(jié)果顯示，低糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)時成熟脂肪細(xì)胞形成率明顯增高，誘導(dǎo)液2作用時間為3d時，成熟脂肪細(xì)胞形成率明顯高于其他組。
圖3 不同葡萄糖濃度對3T3-L1細(xì)胞成脂肪分化的影響
Figure2 Results of different time points during adipogenic differentiation of 3T3-L1 cells
圖4 誘導(dǎo)劑II作用時間對3T3-L1細(xì)胞成脂肪分化的影響
圖5 3T3-L1細(xì)胞成脂肪分化過程中不同時間點(diǎn)結(jié)果記錄（條件下）
注：文中圖片來源于網(wǎng)絡(luò)，僅供學(xué)習(xí)參考用
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胞胞巴適本期推薦：
貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
abs9483 | DMEM高糖培養(yǎng)基（含L-谷氨酰胺，含丙酮酸鈉，不含HEPES） | 500mL |
abs978 | 新生牛血清（優(yōu)級） | 500mL |
abs9244 | 青霉素-鏈霉素溶液（100×，雙抗） | 100mL |
abs47014937 | 胰蛋白酶消化液（0.25%，含酚紅） | 100mL |
abs9187 | 二甲基亞砜（細(xì)胞培養(yǎng)級） | 50mL |
abs817348 | IBMX | 25mg |
abs9294 | 油紅O染色液-改良型 | 3×20mL |
參考文獻(xiàn)
[1] Ling HY, Wen GB, Feng SD, Tuo QH, Ou HS, Yao CH, Zhu BY, Gao ZP, Zhang L, Liao DF. MicroRNA-375 promotes 3T3-L1 adipocyte differentiation through modulation of extracellular signal-regulated kinase signalling. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2011 Apr;38(4):239-46. doi: 10.1111/j.1440-1681.2011.05493.x. PMID: 21291493; PMCID: PMC3086632.
[2] 張軼博,鐘悅,曾瑞霞.HAmLET誘導(dǎo)小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1成脂分化[J].錦州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2022,43(04):14-19.
[3] 張曉琴. 優(yōu)化3T3L1細(xì)胞成脂誘導(dǎo)模型并初步探討miR-222-3p對脂肪生成的作用[D].湖北中醫(yī)藥大學(xué),2020.
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