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外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC）是外周血（即除骨髓以外的血液）中具有單個(gè)核的細(xì)胞的混合細(xì)胞群體，包括自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）、T淋巴細(xì)胞（70%-90%）、B淋巴細(xì)胞。能夠進(jìn)一步分離純化，是免疫細(xì)胞的主要來(lái)源。

表1 PBMC組分及占比

單核細(xì)胞（monocyte）是血液中最大的白細(xì)胞，來(lái)源于骨髓中的造血干細(xì)胞，并在骨髓中發(fā)育，當(dāng)它們從骨髓進(jìn)入血液時(shí)仍然是尚未成熟的細(xì)胞，與各種細(xì)胞因子一起培養(yǎng)，可定向分化為巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞等。注意不要把單個(gè)核細(xì)胞和單核細(xì)胞兩者的概念混淆。

圖1 單核細(xì)胞（左）和淋巴細(xì)胞（右）

PBMC是免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分，作為免疫學(xué)、惡性腫瘤、疫苗研發(fā)、移植治療等方向最基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)原料被廣泛使用。分離外周血單個(gè)核細(xì)胞成為了免疫細(xì)胞研究的基礎(chǔ)，外周血單個(gè)核細(xì)胞比重為1.070左右，而紅細(xì)胞和多核白細(xì)胞的比重超過(guò)1.080。這樣利用介于兩者比重之間的溶液做密度梯度離心，就可得到單個(gè)核細(xì)胞。常用的是聚蔗糖和泛影酸鈉混合比重為1.070±0.001的溶液，國(guó)內(nèi)常用泛影葡胺代替泛影酸鈉。

圖2 PBMC分離提取示意圖

PBMC分離提取操作步驟：

1）用無(wú)菌稀釋液將血樣稀釋2-4倍；
2）在50ml錐底離心管中先加入15-20ml分離液，然后緩慢加入20-30ml經(jīng)稀釋的全血或組織細(xì)胞懸液至分離液液面之上。（適當(dāng)增加分離液的使用量，將有利于提高單個(gè)核細(xì)胞純度）；
3）室溫400g離心15-30min，保證轉(zhuǎn)子速度平穩(wěn)下降；
4）將離心管小心地從離心機(jī)中取出，緩緩地吸去最上層，避免接觸單個(gè)核細(xì)胞層；
5）將單個(gè)核細(xì)胞層緩慢轉(zhuǎn)移到另一支50ml錐底離心管中；
6）加入無(wú)菌洗滌液并混勻后，室溫下300g離心10min，小心棄掉上清；
7）為了去除殘余血小板，可將細(xì)胞重懸于30-50ml無(wú)菌洗滌液中，室溫200g離心10-15min，小心棄掉上清；
8）可選擇地重復(fù)第7步，將會(huì)去除絕大部分血小板；
9）將細(xì)胞用緩沖液或培養(yǎng)基重懸后進(jìn)行檢測(cè)、培養(yǎng)等后續(xù)操作。

此法操作得當(dāng)，單個(gè)核細(xì)胞得率可達(dá)80%-90%，影響得率最重要的因素是分層液的比重。

圖3 分離培養(yǎng)的PBMC

PBMC激活：

PBMC一般需要加細(xì)胞因子刺激，否則很快就會(huì)凋亡。推薦使用包被法。

1）六孔板 5μg/mL CD3 800μL（室溫2h 或 4℃過(guò)夜）；

2）加入 RPMI-1640培養(yǎng)基(abs9484)+優(yōu)級(jí)胎牛血清(abs972)+1μg/mL CD28+100IU/mL IL-2，細(xì)胞密度建議1-2×10⁶/ml, 刺激2-3d；

細(xì)胞因子濃度、種類及細(xì)胞數(shù)量可根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼{(diào)整。

PBMC凍存：

10% DMSO(abs9187)+FBS(abs972)

1）制備含20%DMSO的FBS溶液，置于冰上。（100%DMSO在冰上會(huì)形成冰晶）;
2）確保PBMC為單細(xì)胞懸液。300×g離心10min，棄上清；
3）按1-20×10⁶cells/mL的濃度將PBMC重懸于預(yù)冷的FBS中；
4）按1:1的比例將細(xì)胞和含20%DMSO的FBS混合?？焖賹?mL的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到凍存管；
5）將凍存管立即放入梯度降溫盒中，在-80℃的冰箱中放置過(guò)夜后立即轉(zhuǎn)入液氮。

PBMC離體之后越快冷凍越能保證其活性及功能。當(dāng)全血離體一段時(shí)間后，再使用Ficoll進(jìn)行分離，中性粒細(xì)胞會(huì)被活化，從而嚴(yán)重影響密度梯度離心得到PBMC的效率，從靜置24h后的模擬運(yùn)輸環(huán)境中分離得到的PBMC，其組分中T細(xì)胞和NK細(xì)胞含量會(huì)發(fā)生明顯變化，對(duì)刺激的反應(yīng)也會(huì)弱化。

今天的文章就到這里啦，PBMC還有很多相關(guān)實(shí)驗(yàn)，歡迎大家公主號(hào)“愛必信生物"后臺(tái)留言，一起探討更多細(xì)胞培養(yǎng)問(wèn)題。

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* 注：文中圖片來(lái)自網(wǎng)絡(luò)，僅供學(xué)習(xí)參考用

Gebauer B S, Hricik D E, Atallah A, et al. Evolution of the enzyme‐linked immunosorbent spot assay for post‐transplant alloreactivity as a potentially useful immune monitoring tool[J]. American journal of transplantation, 2002, 2(9): 857-866.

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