宿主相關(guān)微生物群在動物健康和發(fā)育中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，了解微生物群和內(nèi)在發(fā)育途徑之間的關(guān)系是制定策略以促進病原體應(yīng)激下腸道穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵。動物模型已被用于研究許多生物學(xué)問題，但往往過于復(fù)雜，無法直接闡明腸道微生物群和上皮細(xì)胞之間的相互作用，而具有不同微生物群的腸類器官共培養(yǎng)模型使這些復(fù)雜的相互作用能夠在體外進行研究。
2022年9月27日，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院侯起航等在Cell Reports（IF=9.995）雜志上發(fā)表了題為“Bacillus subtilis programs the differentiation of intestinal secretory lineages to inhibit Salmonella infection"的研究論文，作者成功建立了腸道類器官-細(xì)菌多層次共培養(yǎng)模型這一國際前沿技術(shù)，為菌群-腸上皮互作領(lǐng)域提供了全新的視角。下面，小愛帶您一起學(xué)習(xí)此文章的幾大亮點。
亮點一：建立細(xì)菌和腸道類器官共培養(yǎng)體系
根據(jù)圖1中的模式圖構(gòu)建包含不同細(xì)菌和腸道類器官的共培養(yǎng)系統(tǒng)。簡述如下：在冷PBS中收獲類器官，并清洗一次以去除基質(zhì)。用 1mL 注射器大力吸取類器官以誘導(dǎo)機械破壞，獲得類器官芽。剪切后，將芽在高級DMEM/F12（Gibco）中洗滌一次，然后與活的枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌，大腸桿菌在 37℃ 1mL 培養(yǎng)基中共同孵育 2 小時后，用培養(yǎng)基洗滌類器官芽一次，以去除未結(jié)合的細(xì)菌。然后，將類器官芽重新包埋在24孔組織培養(yǎng)板中的 50 mL 基質(zhì)膠中，并在 37℃、5% CO2、500 mL 培養(yǎng)基中孵育 3-7 天。
圖1 小腸類器官中構(gòu)建細(xì)菌共培養(yǎng)模型的模式圖
圖2 活枯草芽孢桿菌或HK枯草芽孢桿菌刺激1至7天的類器官生長狀態(tài)性圖
亮點二：枯草芽孢桿菌以 LTA-TLR2 依賴的方式抑制 Notch 通路信號傳導(dǎo)
為了確定TLR2在枯草芽孢桿菌介導(dǎo)的Notch信號抑制中的作用，他們首先從野生型（WT）和TLR2基因敲除小鼠中獲得小腸類器官，IF染色和WB分析TLR2蛋白表達情況。盡管差異不顯著（p>0.05），但在枯草芽孢桿菌刺激的TLR2/類器官中，Notch相關(guān)基因（Notch1、Notch2、Jag1、Dll1、Dll4、Hes1和Math1）的表達呈上升趨勢。為進一步探索TLR2-Myd88依賴性信號傳導(dǎo)的作用，他們用枯草芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基上清液、TLR2激動劑（LTA）、TLR2抑制劑（CUCPT22，abs814483）及其組合處理WT小鼠的小腸類器官3天，結(jié)果表明TLR2-Myd88依賴性信號傳導(dǎo)對枯草芽孢桿菌誘導(dǎo)的分泌細(xì)胞擴增至關(guān)重要（圖3）。
圖3 TLR2對枯草芽孢桿菌誘導(dǎo)的分泌細(xì)胞擴增至關(guān)重要
亮點三：枯草芽孢桿菌增加粘蛋白和抗菌肽的產(chǎn)生以抵御鼠傷寒沙門氏菌感染。
為建立一個代表沙門氏菌感染的腸道類器官培養(yǎng)系統(tǒng)，研究者首先用致病性鼠傷寒沙門氏菌SL1344感染腸道類器官（如圖4A）。他們發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌感染導(dǎo)致正常類器官形態(tài)的破壞，在光學(xué)顯微鏡下可以看到大量死亡細(xì)胞。進一步發(fā)現(xiàn)，大量鼠傷寒沙門氏菌細(xì)胞侵入了類器官（圖4B）。為了觀察鼠傷寒沙門氏菌對小腸類器官的入侵，他們用熒光標(biāo)記的鼠傷寒沙門菌定殖培養(yǎng)物 90分鐘。綠色熒光標(biāo)記的傷寒沙門氏菌附著并入侵類器官（圖4C）。此外，ELISA數(shù)據(jù)顯示，感染后12小時，培養(yǎng)基中的炎癥細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1b（IL-1b）和腫瘤壞死因子a（TNF-a）水平較高（圖4D和4E）。
圖4 鼠傷寒沙門氏菌在小鼠小腸類器官中的感染和侵襲
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