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2023年2月8日，俄亥俄州立大學(xué)董一州團隊在Advanced Science發(fā)表了一篇LNP成功遞送saRNA至精母細胞治療小鼠不育的文章“Cholesterol-Amino-Phosphate (CAP) Derived Lipid Nanoparticles for Delivery of Self-Amplifying RNA and Restoration of Spermatogenesis in Infertile Mice"。

基因突變引起的男性不育癥是不育癥的重要類型。目前，臨床上還沒有可靠的方法來解決這種醫(yī)療需求。

mRNA療法的出現(xiàn)為修復(fù)生殖系統(tǒng)中的突變基因提供了一種可能的策略。然而，將mRNA有效遞送至精母細胞仍然是一項艱巨的挑戰(zhàn)。因此，研究團隊希望開發(fā)一種新的LNP可以將saRNA有效遞送至精母細胞，用于治療男性不育癥。

一、CAP LNP的合成、配方和表征

為了增強mRNA遞送進入精子細胞，在生物膜和男性生殖系統(tǒng)起到關(guān)鍵作用的一些生物活性分子引起研究人員的關(guān)注。例如，膽固醇是哺乳動物細胞膜的重要結(jié)構(gòu)成分，維持細胞膜的完整性和通透性。先前有研究報道在精子生成過程中膽固醇水平會升高，這表明膽固醇代謝與生育能力之間存在密切關(guān)系。此外，磷酸基團是磷脂的極性部分，同時也是是生物膜的關(guān)鍵組成部分，參與細胞運輸途徑。最后，氨基可以電離變?yōu)檎娦缘?，與帶負電的mRNA相互作用。除了生物活性之外，可電離的脂質(zhì)的幾何結(jié)構(gòu)，可以用包封參數(shù)（P值）來描述，會極大地影響 LNPs的傳遞效率。通常，P 值大的脂質(zhì)有利于形成倒錐形，有利于內(nèi)體膜的倒六邊形（HII 相）轉(zhuǎn)變和遞送貨物的內(nèi)體逃逸。

為了實現(xiàn) LNPs 將編碼功能蛋白的 mRNA 遞送進精母細胞中，恢復(fù)精子生成的目標(biāo)，他們整合了3個生物活性分子單元，設(shè)計一系列膽固醇-氨基-磷酸酯(CAP)脂質(zhì)，配制成CAP LNPs。CAP LNP 由CAP、DOPE、DMG-PEG和編碼Dmc1的mRNA配制而成。在顯微注射到曲細精管后，CAP LNP將Dmc1 mRNA遞送到精母細胞，從而恢復(fù)染色體重組和精子發(fā)生。

圖1 使用CAP LNP遞送編碼Dmc1的 mRNA 的示意圖

首先，研究團隊構(gòu)建了一條 CAP 衍生物的合成路線（圖 2a），并進一步表征了它們的理化性質(zhì)，最終選擇了CAP2-4 LNPs進行后續(xù)研究。研究者應(yīng)用 CAP2-4 LNP 在Dmc1 ^-/-小鼠模型中遞送綠色熒光蛋白(GFP) mRNA，24小時后分析 GFP 的表達。如圖 2e所示，CAP2-4 LNPs 在曲細精管周圍誘導(dǎo)出明顯的綠色熒光，而 MC3 LNPs 和 ALC-0315 LNPs 組中幾乎檢測不到 GFP 信號。這些結(jié)果證明 CAP2-4 LNPs 是精母細胞中 mRNA 遞送的優(yōu)良載體，遞送效率明顯高于 MC3 和 ALC-0315 LNPs。

圖2 CAP 脂質(zhì)的合成方法、3D結(jié)構(gòu)以及在生精小管中的遞送效率比較

二、CAP LNP可將saRNA遞送至Dmc1^-/-小鼠模型中的精母細胞

接下來，作者比較了傳統(tǒng) mRNA和saRNA 之間 Dmc1 蛋白的表達時程。他們將帶有 Flag 標(biāo)簽的 Dmc1 mRNA 或 saRNA 封裝到CAP2-4 LNP 中，并將兩種制劑注射到 Dmc1^-/-小鼠的曲細精管中。給藥后24和72小時，通過免疫熒光染色評估曲細精管中 Dmc1 的表達。如圖3a所示，在CAP2-4 LNP-mRNA和CAP2-4 LNP-saRNA 處理的小鼠中24小時均觀察到明顯的 Dmc1 表達，但在未處理的小鼠中則沒有。CAP2-4 LNP-mRNA給藥72小時后，曲細精管中幾乎沒有熒光信號（圖3b）。相反，CAP2-4 LNP-saRNA處理組仍然顯示出強烈的熒光信號（圖3b）。這些結(jié)果表明，通過 CAP2-4 LNP 遞送 saRNA 可以維持 Dmc1 蛋白表達至少三天。

圖3 在 Dmc1^-/-小鼠中遞送編碼 Dmc1蛋白的傳統(tǒng)mRNA或saRNA

三、使用CAP LNP遞送saRNA恢復(fù)Dmc1蛋白功能

隨后，作者通過分析聯(lián)會復(fù)合體(SC)來檢查 Dmc1 蛋白的功能。SC 是在減數(shù)分裂 I 期間形成的特定結(jié)構(gòu)，負責(zé)同源染色體的聯(lián)會。由于 Dmc1 缺陷可破壞 SC 形成并阻止減數(shù)分裂 I 后期的精子發(fā)生，因此 SC 被認為是 Dmc1 蛋白功能恢復(fù)的關(guān)鍵指標(biāo)。Dmc1^-/-小鼠用 CAP2-4 LNP-saRNA 處理，處理后第4天，收集睪丸。通過 SYCP1 和 SYCP3（參與 SC 形成的兩個主要成分）的免疫熒光染色檢查精母細胞中的 SC。如圖4a所示, SYCP3和SYCP1染色清楚地顯示了 WT 小鼠的五個亞階段的特征模式，包括細線期、偶線期、粗線期、雙線期、終變期。在CAP2-4 LNP-saRNA 處理組中，我們觀察到處于粗線期的SC，這表明同源染色體聯(lián)會的恢復(fù)。此外，對SC在雙線期和終變期的觀察進一步證實了SC可以解體并轉(zhuǎn)運到中期（圖4b）。相反，來自 Dmc1^-/-小鼠的 SC 在前期的早期階段被阻滯，并且未觀察到粗線期、雙線期和終變期的 SC（圖4c）。如圖4d所示，在 CAP2-4 LNP-saRNA 處理后，粗線期、雙線期和終變期精母細胞的百分比分別增加到 11%、6% 和 2%?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明使用 CAP LNP 遞送 saRNA 可恢復(fù)精母細胞中 Dmc1 蛋白的功能。

圖4 使用CAP LNP遞送saRNA可恢復(fù)Dmc1^-/-小鼠中的Dmc1功能

四、CAP LNP-saRNA 挽救 Dmc1^-/-小鼠的精子發(fā)生

最后，作者研究了通過 CAP2-4 LNP-saRNA 恢復(fù) Dmc1 蛋白是否可以挽救 Dmc1^-/-小鼠的不育癥。Dmc1^-/-小鼠用 CAP2-4 LNP-saRNA 處理。處理后第10天，收集睪丸和附睪。睪丸和附睪切片用花生凝集素(PNA)染色，它可以特異性結(jié)合精子細胞頂體（圖5a）。PNA 染色的精子細胞位于 WT 小鼠的曲細精管和附睪管中。然而，Dmc1^-/-小鼠的睪丸和附睪中沒有細胞被 PNA-凝集素染色，表明精子細胞生產(chǎn)喪失。相比之下，我們在 CAP2-4 LNP-saRNA 治療組的曲細精管和附睪管中觀察到了 PNA染色的細胞，這是挽救 Dmc1^-/- 小鼠不育表型的直接證據(jù)。統(tǒng)計分析顯示，治療組每根小管的PNA陽性細胞數(shù)明顯高于未治療組，達到WT組的二分之一左右（圖5b）。因此，這些結(jié)果證明，使用 CAP LNP 遞送 saRNA可以有效挽救 Dmc1^-/-小鼠中的精子細胞產(chǎn)生。

此外，對睪丸樣本進行組織學(xué)分析以評估生精發(fā)育。如圖5c所示，WT 小鼠表現(xiàn)出正常的睪丸形態(tài)，而 Dmc1^-/-小鼠在精母細胞階段表現(xiàn)出精子發(fā)生停滯并且缺乏減數(shù)分裂后細胞。與 WT 小鼠相比，Dmc1^-/-小鼠的生發(fā)層厚度和生精管直徑顯著降低（圖5d，e）。相比之下，CAP2-4 LNP-saRNA 重建了 Dmc1^-/-小鼠的睪丸形態(tài)，增加了生發(fā)層厚度和生精管直徑（圖5d，e)。精子懸液細胞學(xué)涂片顯示，CAP2-4 LNP-saRNA處理組的附睪產(chǎn)生橢圓頭單尾不卷曲的精子，而未處理組未觀察到精子樣細胞（圖5f）。

圖5 使用 CAP LNP 遞送saRNA可挽救 Dmc1 ^-/-小鼠的不育表型

總的來說，這項研究利用 CAP LNPs 可以向精母細胞傳遞 mRNA，證明基于mRNA療法在治療由基因突變引起的男性生殖疾病方面的可行性。Absin擁有成熟的mRNA制備及LNP包裹技術(shù)。

線性mRNA定制流程：

線性mRNA定制化合成/定制化服務(wù) 服務(wù)參數(shù)： 1、合成量大于等于200ug/條 2、加帽方式：化學(xué)共轉(zhuǎn)錄法 推薦帽結(jié)構(gòu)：CynCap AG 3、修飾堿基： N1-methyl-Pseudouridine-5'-Triphosphate 4、標(biāo)準定制UTR：Cyn-CBT  5、序列設(shè)計：1條（定制化合成）；不少于3條（定制化服務(wù)） 6、標(biāo)準質(zhì)控：RNA完整性檢測，RNA純度膠圖 7、可選實驗：LNP包裹（請詢價） 8、合成周期：2-4周（定制化合成，不包括細胞驗證） 4-8周（定制化服務(wù)）

環(huán)狀RNA定制流程：

環(huán)狀RNA定制化合成/定制化服務(wù) 服務(wù)參數(shù)： 1、合成量大于等于200ug/條 2、標(biāo)準IRES：CYN-IRES-G 3、合成序列條數(shù)大于等于1條（定制化合成）；不低于3條（定制化服務(wù)） 4、標(biāo)準交付：1.0 ug/ul 5、標(biāo)準質(zhì)控：濃度；純度 6、合成周期：4-8周（定制化合成）；6-8周（定制化服務(wù)）

標(biāo)準臨床概念驗證方案流程：

標(biāo)準臨床概念驗證方案是我司新推出的專項服務(wù)，可以同時匹配mRNA線性/環(huán)狀技術(shù)，協(xié)助快速推進靶點的概念驗證，推進不同構(gòu)型的mRNA技術(shù)在動物實驗上獲得藥效學(xué)結(jié)果，以期能夠快速進入轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的級別。

對于mRNA定制業(yè)務(wù)及技術(shù)感興趣的客戶歡迎聯(lián)系我們進行詳細咨詢、交流。 

[1] Du S, Li W, Zhang Y, et al. Cholesterol-Amino-Phosphate (CAP) Derived Lipid Nanoparticles for Delivery of Self-Amplifying RNA and Restoration of Spermatogenesis in Infertile Mice. Adv Sci (Weinh). 2023 Feb 7:e2300188.

Absin特色產(chǎn)品線：

WB相關(guān)：ECL發(fā)光液、預(yù)染marker、預(yù)制膠；IHC相關(guān)：二抗試劑盒、組化筆；IP/CoIP試劑盒；激動劑/抑制劑；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡試劑盒；呼吸爆發(fā)試劑盒；ELISA試劑盒；重組蛋白；抗體: 二抗、標(biāo)簽抗體、對照抗體；定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測)...