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對(duì)于做過分子實(shí)驗(yàn)的小伙伴來說，傳統(tǒng)的分子克隆技術(shù)——酶切連接，大家應(yīng)該都是比較熟悉的，那么對(duì)于其他的分子克隆技術(shù)類型大家有了解過嗎？根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求，來選擇不同的分子克隆技術(shù)以及產(chǎn)品。本期，小愛帶大家一起來了解下幾種常規(guī)的分子克隆技術(shù)吧。

一、酶切連接

酶切連接法屬于經(jīng)典的分子克隆方法，利用限制性內(nèi)切酶切割DNA和利用DNA連接酶連接DNA，最后轉(zhuǎn)化篩選及純化，完成重組基因的大量制備。

圖1 酶切連接流程

成功的酶切和有效的連接是分子克隆實(shí)驗(yàn)圓滿完成的必要條件。限制性內(nèi)切酶能特異性地結(jié)合于能被限制性內(nèi)切酶識(shí)別的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異性位點(diǎn)上，并切割雙鏈DNA。根據(jù)限制酶的識(shí)別切割特性、催化條件以及是否有修飾酶活性，可分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。分子克隆技術(shù)中常用的是Ⅱ型酶，切割后得到的是帶粘性末端或平末端的線性DNA。

粘性末端，即限制性內(nèi)切酶在DNA雙鏈上交錯(cuò)切割，形成的核苷酸順序互補(bǔ)的，可形成氫鍵的末端（見圖2）。

平齊末端，限制性內(nèi)切酶在DNA雙鏈的相同位置切割DNA分子，這樣形式的斷裂是形成具有平末端的DNA片斷（見圖3）。

圖2 EcoR I切割DNA形成粘性末端DNA片段

圖3 AluI切割DNA形成平末端DNA片段

Absin擁有目前常用的幾種限制性內(nèi)切酶，包括快速內(nèi)切酶BsaI(abs60206)、快速內(nèi)切酶ClaI(abs60209)、快速內(nèi)切酶EcoRI(abs60213)、快速內(nèi)切酶HindIII(abs60217)等四十多種。

Absin限制性內(nèi)切酶產(chǎn)品特點(diǎn)：

1、快速酶切：5-15min即可完成酶切；
2、通用的buffer：大大簡(jiǎn)化了酶切反應(yīng)；
3、高保真：極低的星號(hào)活性；
4、高度冗余：輕松應(yīng)對(duì)過量、復(fù)雜底物；
5、良好的兼容：經(jīng)驗(yàn)證所有Absin快速內(nèi)切酶與其他品牌酶切體系相互兼容。

表1 Absin限制性內(nèi)切酶介紹

核酸片段可以通過連接酶的作用連接起來而獲得重組分子。DNA接酶催化雙鏈DNA子中相鄰堿基的5’-P末端與3-0H間形成3’,5’-磷酸二酯鍵。常用的DNA連接酶是T4 DNA連接酶——T4 DNA Ligase(abs60084)，被稱為生物界的“502"。在有Mg²⁺和ATP存在的條件下，T4 DNA Ligase能催化雙鏈DNA或RNA上相鄰的5′-磷酸末端和3′-羥基末端形成磷酸二酯鍵。該酶不僅能夠催化雙鏈DNA的平末端或粘性末端之間的連接，還可以修復(fù)雙鏈DNA、RNA或DNA/RNA雜交雙鏈中的單鏈切刻，但不能催化單鏈DNA之間的連接。

圖4 T4 DNA連接酶作用位點(diǎn)

二、TA克隆

TA克隆是指把PCR片段與一個(gè)具有3‘-T突出的載體DNA連接起來的方法?？捎糜诓磺宄康幕虻腄NA序列，獲得的目的片段通常需要通過TA克隆的方法重組到T-載體中，通過測(cè)序測(cè)定DNA序列。Absin T-Vector快速克隆試劑盒(abs60085)是高效、便利的PCR產(chǎn)物克隆專用試劑盒。

Absin T-Vector快速克隆試劑盒(abs60085)產(chǎn)品特點(diǎn)：

1、陽性率高：高純度酶切型線性T載體，連接效率更高，藍(lán)斑率低于10% ；
2、方便快捷：預(yù)混連接反應(yīng)體系，最快5分鐘實(shí)現(xiàn)連接，無需純化，直接轉(zhuǎn)化；
3、T Simple載體無常用酶切位點(diǎn)，利于含酶切位點(diǎn)基因克??；
4、無NdeI或NcoI位點(diǎn)，便于重組表達(dá)基因的克??；
5、提供純化的PCR片段作為陽性質(zhì)控對(duì)照；
6、藍(lán)白篩選：高表達(dá)活性的β-半乳糖苷酶，顯色更快更深；
7、批次穩(wěn)定：遵循標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)流程，經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)。

圖5 TA克隆流程

三、無縫克隆

無縫克隆技術(shù)是一種新的、快速、簡(jiǎn)潔的克隆方法，可以在質(zhì)粒的任何位點(diǎn)進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)DNA的片斷的插入，而不需要任何限制性內(nèi)切酶和連接酶，只需要一步重組法，即可得到高效率克隆的重組載體，大大提高了工作效率。Absin快速多片段DNA組裝預(yù)混液(abs60250)就是基于重組原理的無縫克隆技術(shù)，它不依賴繁瑣的酶切、連接步驟，也不需要末端補(bǔ)平等操作，依據(jù)DNA片段與線性化載體末端的15~25nt 同源序列的重組，可將插入片段克隆至任意線性載體的任意位點(diǎn)，載體自連背景極低，是一種簡(jiǎn)單、快速、高效的DNA定向克隆技術(shù)。

Absin快速多片段DNA組裝預(yù)混液(abs60250)特點(diǎn)：

1、簡(jiǎn)單便捷：兼容PCR產(chǎn)物體系與載體酶切體系，省去繁瑣的純化步驟；

2、高陽性率：定向克隆單個(gè)DNA片段至載體上，陽性率高于95%；

3、快速反應(yīng)：反應(yīng)時(shí)間大大縮短，最快僅需5min；

4、單/多片段均可連接：?jiǎn)蝹€(gè)或多個(gè)片段同時(shí)插入，省去重復(fù)純化與酶切過程。

圖6 Absin快速多片段DNA組裝預(yù)混液(abs60250)無縫克隆操作流程

四、TOPO克隆

TOPO克隆實(shí)際是基于拓?fù)洚悩?gòu)酶的克隆技術(shù)，關(guān)鍵是拓?fù)洚悩?gòu)酶。該技術(shù)不需要限制性內(nèi)切酶或外源連接酶，從而提供了將新的PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒中的極其簡(jiǎn)便快捷的方法。

TOPO克隆產(chǎn)品特點(diǎn)：快捷，不需連接酶，克隆三步到位。

表2 愛必信TOPO克隆產(chǎn)品

五、Geteway克隆

Geteway克隆利用位點(diǎn)特異重組實(shí)現(xiàn)目的片段的插入的，載體上的一段目的片段在重組酶的作用下會(huì)替換成目的片段，不依賴限制性內(nèi)切酶和連接酶，導(dǎo)入目的基因不需要開環(huán)處理，載體需要用試劑盒提供的載體，一般需要用到兩個(gè)載體，快速、高效將DNA序列轉(zhuǎn)移到載體上的克隆。

Absin特色產(chǎn)品線：

WB相關(guān)：ECL發(fā)光液、預(yù)染marker、預(yù)制膠；IHC相關(guān)：二抗試劑盒、組化筆；IP/CoIP試劑盒；激動(dòng)劑/抑制劑；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡試劑盒；呼吸爆發(fā)試劑盒；ELISA試劑盒；重組蛋白；抗體: 二抗、標(biāo)簽抗體、對(duì)照抗體；定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...