細(xì)胞培養(yǎng)也叫細(xì)胞克隆技術(shù)，在生物學(xué)中的正規(guī)名詞為細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。不論對于整個生物工程技術(shù)，還是其中之一的生物克隆技術(shù)來說，細(xì)胞培養(yǎng)都是一個不可少的過程，細(xì)胞培養(yǎng)本身就是細(xì)胞的大規(guī)?？寺?。
細(xì)胞培養(yǎng)的步驟
1、復(fù) 蘇
細(xì)胞復(fù)蘇的原則：快速融化
必須將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至37℃，使細(xì)胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對細(xì)胞造成損害。
實驗前準(zhǔn)備
將水浴鍋提前預(yù)熱至37℃。
細(xì)胞實驗室進(jìn)行常規(guī)消毒，用75%酒精擦拭紫外線照射40min的超凈工作臺臺面，保證無菌。
在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等即將使用的耗材及試劑。
取出凍存管
根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的對應(yīng)編號。
從液氮罐中取出細(xì)胞盒，取出所需的細(xì)胞，同時核對管外的編號。
迅速解凍
迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化。
約1-2min后凍存管內(nèi)液體溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內(nèi)。
平衡離心
用架盤天平平衡后，放入離心機(jī)中3000r/min 離心3分鐘。
制備細(xì)胞懸液
吸棄上清液。
向離心管內(nèi)加入適量培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液。
用培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
細(xì)胞計數(shù)
細(xì)胞濃度以5×105/ml為宜。
培養(yǎng)細(xì)胞
將符合細(xì)胞計數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4h(或者24-48h)后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時間根據(jù)細(xì)胞情況而定。
記錄復(fù)蘇日期
2、傳 代
01、傳代密度過高
一旦細(xì)胞養(yǎng)太久至融合度過高(>90%)才傳代，容易使細(xì)胞產(chǎn)生老化現(xiàn)象，甚至是堆疊，再消化細(xì)胞時不易吹打成單顆細(xì)胞，即便再重新鋪盤傳代，細(xì)胞也無法回到原本的特性了。(如：單層細(xì)胞，沒長滿就發(fā)生堆疊現(xiàn)象)。
解決方案
盡量避免融合度過高，鏡下觀察融合度約達(dá)到80%即可傳代分盤。
細(xì)胞融合度：在細(xì)胞培養(yǎng)中指的是細(xì)胞在培養(yǎng)表面(培養(yǎng)皿/瓶)所占的比例。
02、傳代密度過低
哺乳動物貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，若細(xì)胞培養(yǎng)到80-90%密度需要開始傳代，在傳代接種細(xì)胞密度過低，細(xì)胞間距離太遠(yuǎn)，就無法在細(xì)胞間產(chǎn)生黏附及通信作用，幫助信號傳導(dǎo)并活化細(xì)胞；總體細(xì)胞量不足，分泌的生長因子濃度會不足以產(chǎn)生利于生長的微環(huán)境，以上皆會造成增殖速度遲緩或細(xì)胞死亡。
解決方案
細(xì)胞傳代時，要進(jìn)行準(zhǔn)確的細(xì)胞計數(shù)，確保鋪盤的密度。
3、凍 存
細(xì)胞凍存的基本原理：慢凍
手動降溫：將細(xì)胞依序放在4℃(30分鐘)、-20℃(1小時)、-80℃(過夜)后移至液氮中保存。
程序降溫盒：是一般廣泛使用的降溫法，為一種特制冷凍容器(填充異丙醇或依靠特制金屬導(dǎo)熱)，使細(xì)胞以每分鐘約-1℃的速度降至-80℃(過夜)，然后移至液氮中保存。
由此可以看出，程序降溫精準(zhǔn)度更高，優(yōu)于手動降溫。
部分低溫保護(hù)劑在緩慢冷凍過程中雖然會保護(hù)細(xì)胞，但它們也會引起細(xì)胞毒性，尤其是在室溫下。因此，在標(biāo)準(zhǔn)的自制凍存液中，會含有血清，血清是用來降低細(xì)胞毒性的，但血清也不是完整的。
8
立即詢價
您提交后，專屬客服將第一時間為您服務(wù)