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類器官傳代培養(yǎng)全流程及答疑解惑

閱讀:1103      發(fā)布時間:2022-11-30
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準備工作
1.儀器設備
CO2 培養(yǎng)箱、雙人單面超凈臺、倒置顯微鏡、臺式冷凍離心機、水浴鍋、水浴搖床,醫(yī)用冰箱、-80°冰箱、移液器(一套)。

2.試劑耗材
小腸類器官培養(yǎng)基、小腸類器官緩沖液、類器官傳代消化液、硫酸慶大霉素、雙抗、基質膠、60mm細胞培養(yǎng)皿、15ml離心管、1.5ml EP管若干、4度冰盒。

 

操作流程
1.類器官操作流程之——樣本準備
(1)移液器吸去培養(yǎng)基,每孔添加1-2ml 4℃類器官緩沖液B放置2min。


(2)移液搶輕柔吹打基質膠,收集在15ml離心管中,4℃靜置10min。(每6-8孔為一組)。



2. 
類器官傳代培養(yǎng)之——樣本消化

A:類器官數(shù)量不足或體積較小時: 離心5min棄去上清,添加適量小腸類器官緩沖液重懸移入1.5ml離心管,300g離心5min棄去液體進行第3步。

B:類器官數(shù)量較多或體積較大時:離心5min棄去上清,添加適量類器官傳代消化液D消化2-3min,添加小腸類器官緩沖液終止消化,離心5min棄去混合液,添加適量小腸類器官緩沖液重懸移入1.5ml離心管,300g離心5min棄去液體進行第3步。


3. 類器官傳代培養(yǎng)之——鋪板

類器官收集后,添加基質膠重懸,每孔25μl基質膠鋪在24孔細胞培養(yǎng)板中,放置培養(yǎng)箱中10-15min添加500μl小腸類器官培養(yǎng)基。



答疑解惑

 

Q1:類器官培養(yǎng)一代需要多長時間?

A:一般需要5-7天,長得快可3-5天。

Q2: 初始量樣本量10*5,活性大于90%,可以培養(yǎng)出多少類器官?

A:培養(yǎng)一代,一般是24孔板的10個孔。

Q3:原代培養(yǎng)中消化下來的細胞是只有干細胞嗎?

A:消化下來的細胞包含各個種類的細胞,但是能培養(yǎng)成類器官的只有成體干細胞和腫瘤干細胞,沒有干性的細胞在培養(yǎng)過程中不會增殖分化,養(yǎng)的過程會死掉。

Q4:想要CTC培養(yǎng),需要多少樣本量呢?

A:至少50+個CTC,取樣時可以多取一些血,CTC細胞占比比較少。

Q5:類器官量多小的時候不需要加消化液?

A:一般是100um以下。

Q6:如果要做藥篩需要額外去除基質膠和培養(yǎng)基嗎?

A:和傳代培養(yǎng)鋪板一樣,藥用培養(yǎng)基稀釋就可以。

Q7:類器官培養(yǎng)一定需要基質膠嗎?

A:基質膠主要是為類器官提供支撐作用和營養(yǎng)物質,基質膠主要成分有l(wèi)aminin,collagen IV,heparan sulfate proteoglycans。

Q8:取材時為什么剔除脂肪組織?脂肪肝可以做類器官培養(yǎng)嗎?

A:脂肪組織影響后續(xù)消化分離得到的干細胞純度,脂肪肝也是可以做類器官培養(yǎng)的,消化前可以多清洗幾次,去掉表面脂肪。

Q9:類器官可以直接用細胞系培養(yǎng)嗎?

A:用細胞系培養(yǎng)的不能成為類器官,只能稱之為細胞球。

 
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詳見:
類器官原代培養(yǎng)全流程

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