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mRNA的5’端的帽子結(jié)構(gòu)可以提高其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、增強翻譯效率以及降低mRNA在細胞中的免疫原性【1】。作為mRNA的重要組成部分，帽子結(jié)構(gòu)可以稱得上是mRNA結(jié)構(gòu)的保護傘。那么，接下來我們就來學習一下帽子結(jié)構(gòu)。

• 帽子結(jié)構(gòu)簡介

帽子結(jié)構(gòu)的化學本質(zhì)是mRNA轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)生修飾所形成的位于mRNA 5'端的一個特殊結(jié)構(gòu)，即m7GPPPN結(jié)構(gòu)，又稱甲基鳥苷帽子。它是在RNA三磷酸酶，鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶，mRNA（鳥嘌呤-N7）甲基轉(zhuǎn)移酶和mRNA（核苷-2’）甲基轉(zhuǎn)移酶共同催化作用下形成的。甲基化程度的不同可形成3種帽子：CAP 0型、CAP 1型和CAP 2型（如圖1）。

 
圖1.不同位置甲基化形成的帽結(jié)構(gòu)【2】

帽子結(jié)構(gòu)是mRNA翻譯起始的必要結(jié)構(gòu)，為核糖體識別mRNA提供了信號，協(xié)助核糖體與mRNA結(jié)合，使翻譯從AUG開始。同時帽子結(jié)構(gòu)可增加mRNA的穩(wěn)定性，保護mRNA免遭5’→3’核酸外切酶的攻擊。除去天然帽結(jié)構(gòu)，體外轉(zhuǎn)錄過程中也多用帽結(jié)構(gòu)類似物提高mRNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，常見的有ARCA和Cap 1結(jié)構(gòu)類似物等。

• 加帽方式及對比

酶法加帽：使用加帽酶進行轉(zhuǎn)錄后加帽，最常使用的是牛痘病毒加帽酶（VCE），該反應過程中加帽酶的異源二聚體會導致產(chǎn)量較低，短期內(nèi)難以放大。特點：先轉(zhuǎn)錄后加帽，由于增加質(zhì)控項目工序繁雜（如圖2），加帽率*，但各類酶成本較高。

共轉(zhuǎn)錄加帽：使用帽類似物進行共轉(zhuǎn)錄加帽，目前常用的帽類似物有兩種ARCA（抗-反帽結(jié)構(gòu)類似物）和Cap1帽類似物。有研究表明Cap 1結(jié)構(gòu)能夠增強mRNA的翻譯效率，從而提高mRNA在轉(zhuǎn)染和顯微注射實驗中的表達。且隨著帽子結(jié)構(gòu)的不斷優(yōu)化，加帽率大幅提升，成本逐漸降低，共轉(zhuǎn)錄加帽法越來越受各類學者青睞。特點：一步法加帽，操作簡單（如圖2），使用Cap 1結(jié)構(gòu)帽類似物，加帽率可達95%，隨著帽結(jié)構(gòu)優(yōu)化研究的深入，成本逐漸降低【3】。

 
圖2. 兩種加帽方式對比

• 三代帽子類似物及其對比

第二代帽結(jié)構(gòu)傳統(tǒng)帽類似物ARCA：Cap 0結(jié)構(gòu)非天然加帽，存在較強免疫原性，加帽率80%左右，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量低約1.5mg/ml，成本高。

第三代帽結(jié)構(gòu)Cap1帽類似物:  Cap 1結(jié)構(gòu)模仿天然加帽，免疫原性降低，加帽率95%左右，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量低約4mg/ml，成本約為ARCA帽類似物的三分之一。

• 愛必信提供幾種類型CAP（AG/AU/GG）

• 帽結(jié)構(gòu)5月上新

除以上帽結(jié)構(gòu)，5月初我們即將重磅推出新修飾Cap 1帽結(jié)構(gòu)以及Cap 2帽結(jié)構(gòu)類似物的相關產(chǎn)品，敬請期待。

【參考文獻】：

• Fabian M, Nils M, Andrea R. Synthetic mRNA capping[J]. Beilstein Journal of Organic Chemistry, 2017, 13:2819-2832.

• Chen, Yu & Guo, Deyin. (2016). Molecular mechanisms of coronavirus RNA capping and methylation. Virologica Sinica. 31. 10.1007/s12250-016-3726-4.

• Henderson JM, Ujita A, Hill E, Yousif-Rosales S, Smith C, Ko N, McReynolds T, Cabral CR, Escamilla-Powers JR, Houston ME. Cap 1 Messenger RNA Synthesis with Co-transcriptional Clean Cap® Analog by In Vitro Transcription. Curr Protoc. 2021 Feb;1(2):e39. doi: 10.1002/cpz1.39. Erratum in: Curr Protoc. 2021 Dec;1(12):e336. PMID: 33524237.