心肌缺血再灌注誘導的心肌細胞外囊泡具有促炎癥特征并加重心臟損傷
影響因子IF:IF14.976
《Journal of Extracellular Vesicles》
本篇文章使用了愛必信產(chǎn)品abs510006 Human TNF-α ELISA Kit
概述
細胞外小泡囊泡（EV）抑制重要的生物學功能。已證明缺血再灌注（IR）誘導心臟中EVs（IR EVs）的釋放增加。然而，IR-EVs在IR病理過程中的作用尚不清楚。本篇文章發(fā)現(xiàn)過繼轉(zhuǎn)移IR-EV加重IR誘導的心臟損傷，GW4869抑制EV可減輕IR損傷。體內(nèi)和體外研究證實IR-EVs促進巨噬細胞M1樣極化，增加促炎細胞因子的表達。此外，該課題組還公開了心臟EV中的miRNA圖譜，并證實與假心臟（S-EVs）中的EV相比，IR EVs中的miRNA（如miR-155-5p）富集。特別是，IR-EVs將miR-155-5p轉(zhuǎn)移到巨噬細胞，并通過激活JAK2/STAT1途徑增強炎癥反應。有趣的是，IR-EVs不僅促進了心臟的局部炎癥，甚至引發(fā)了遠處器官的全身炎癥。綜上所述，我們在IR后的心臟中新發(fā)現(xiàn)了IR-EVs-miR-155-5p-M1極化軸。來自IR損傷心臟的EV可引起局部和全身炎癥。重要的是，GW4869抑制EV被認為是IR損傷的一種有希望的治療策略。
研究背景
急性心肌梗死（MI）是一個全球性問題，發(fā)病率和死亡率都很高（Yeh等人，2010年）?？焖倩謴妥枞墓跔顒用}血流是減少心肌梗死面積和改善心功能的*策略。然而，再灌注會導致不可逆的心肌損傷（Yellon&Hausenloy，2007年），稱為心肌缺血再灌注（IR）損傷（Frank等人，2012年）。心肌缺血再灌注加重了心功能不全，增加了不良預后的發(fā)生率。然而，IR損傷的機制尚不清楚，缺乏有效的治療手段。
炎癥是維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的基本生物學過程。然而，過度的炎癥反應會導致組織損傷。心肌梗死后，早期炎癥與梗死區(qū)的最終大小密切相關（Jose et al.，2014）。巨噬細胞作為MI引發(fā)的炎癥級聯(lián)反應的重要效應器和調(diào)節(jié)器，參與病原體清除和適應性免疫反應的促進。巨噬細胞的極化，如經(jīng)典激活（M1）和替代激活（M2），是實現(xiàn)這些功能的關鍵（Murray，2016）。M1巨噬細胞被稱為促炎型，在吞噬和分泌促炎細胞因子方面起著重要作用，而M2巨噬細胞主要參與炎癥的調(diào)節(jié)和受損組織的修復。MI后促炎性單核細胞或M1巨噬細胞的調(diào)節(jié)具有心臟保護作用（Courties等人，2014年；Harel Adar等人，2011年）。相反，促進M2巨噬細胞的極化可以減輕炎癥，防止心肌梗死后心室重構(gòu)不良（Fan等人，2018年；Wei寧斯等人，2014年）。因此，巨噬細胞在MI和IR損傷中的極化狀態(tài)被認為是一個潛在的治療靶點。
細胞外囊泡（EV）是細胞衍生的具有雙層脂膜的納米級囊泡（Abels&Breakefield，2016）。越來越多的證據(jù)證實了電動汽車作為小區(qū)間通信工具的重要作用（Tkach&Théry，2016）。最近的研究揭示了它們在炎癥調(diào)節(jié)中的作用，并通過調(diào)節(jié)巨噬細胞的極化證實了它們參與了各種疾病的發(fā)展（Lv等人，2020年；Wang等人，2020年；Yin等人，2020年）。我們之前證明了IR后心臟EV釋放顯著增加（Ge等人，2019年）。然而，IR誘導EV（IR EV）的作用仍有待揭示。大量研究表明，非編碼RNA（ncRNA）在心血管疾病中起著重要作用（Beermann等人，2016），尤其是miRNA（Karakas等人，2016；Leistner等人，2016；Mcdonald等人，2015；Zhang等人，2017）。EV可以將特定分子如miRNA（Bang等人，2014；Okoye等人，2014）轉(zhuǎn)移到靶細胞中以調(diào)節(jié)其功能，從而參與發(fā)病機制。在小鼠心肌梗死模型中，循環(huán)EVs中的心肌微RNA動員了骨髓祖細胞，介導了對心臟損傷的系統(tǒng)反應（Cheng等人，2019年）。然而，心臟IR-EV和EV介導的miRNAs是否以及如何在IR損傷中發(fā)揮作用尚不清楚。目前的研究表明IR-EVs加重了IR后的心臟損傷，早期抑制IR-EVs可能是一種有前途的策略。有趣的是，IR-EVs不僅導致IR損傷心臟的無菌性炎癥，甚至誘發(fā)遠處器官的全身性炎癥。特別是，我們鑒定了心臟EV中的miRNA圖譜，并揭示了心臟IR期間IR EV–miR-155-5p–M1極化軸。
實驗過程
1. 建立了小鼠心肌IR模型。
2. 細胞外囊泡分離、獲得懸浮液
3. 透射電子顯微鏡檢測EV樣品
4. 納米顆粒跟蹤分析（NTA）
5. 超聲心動圖進行評估心臟功能
6. 心肌酶檢測和循環(huán)白細胞收集
7. 再灌注24小時后處死小鼠。2,3,5-三苯基四氮唑氯化物（TTC）染色，Image Pro Plus分析。
8. 小鼠心臟切片免疫熒光染色
9. DiI標記的EV與巨噬細胞共培養(yǎng)24小時。DAPI細胞核染色。共聚焦成像。
10. IR-EV用脂質(zhì)體染料DiR預先染色，心臟內(nèi)或尾靜脈注射DiR標記的EVs。使用IVIS成像系統(tǒng)進行生物發(fā)光成像。
11. 小鼠骨髓源性巨噬細胞（BMDM）和腹腔巨噬細胞（PMφ）的分離和培養(yǎng)
12. 檢測巨噬細胞的吞噬功能。
13. 流式細胞術(shù)檢測心臟巨噬細胞的表型。
14. 體外microRNA轉(zhuǎn)染
15. 體內(nèi)microRNA給藥
16. 制備miRNA測序文庫并在Illumina HiSeq測序儀上測序
17. RT-qPCR
18. ELISA檢測蛋白質(zhì)水平
19. Western blot
20. 統(tǒng)計分析
實驗結(jié)果
1. IR引起的心臟EV改變
在TEM下捕獲了來自假心臟或IR損傷心臟的EV的典型形態(tài)（圖1a）。如圖1b所示，假手術(shù)組（S-EVs）和IR-EVs中表達了典型的外顯子標記物，包括CD63、CD9、Alix和TSG101。心肌IR顯著增加了EV的心內(nèi)釋放（圖1c和d），但并未顯著調(diào)節(jié)EV的大?。▓D1e）。
圖1心臟電動汽車的特征。
[（a）假手術(shù)（S-EVs）和IR EVs的代表性TEM圖像，（bar=50 nm）。（b）EVs的蛋白質(zhì)免疫印跡，包括四種典型的外體標記物（Alix、Tsg101、CD63和CD9）。（c）使用納米顆粒追蹤分析（NTA）測量心臟EVs的粒徑分布。（d）（c）對從假手術(shù)和IR損傷心臟分離的EV進行量化。（e） NTA在（c）中檢測到的EV尺寸，P＜0.01；ns，不顯著]
2. IR-EVs加重IR誘導的心臟損傷，促進IR損傷心臟巨噬細胞M1極化
我們之前的研究表明，心肌缺血再灌注后心臟EV釋放增加（Ge等人，2019年）。為了進一步闡明IR EV在心臟IR損傷中的作用，將IR EV輸注到假心臟或IR損傷心臟（圖2a）。生物發(fā)光成像顯示，心臟內(nèi)注射DiR標記的IR EV后24小時，IR EV可保留在心臟內(nèi)（圖2b）。更重要的是，與接受PBS載體的患者相比，輸注IR EV顯著損害心臟功能（圖2c-e）并增加梗死面積（圖2f和g）。與IR+PBS小鼠相比，IR+IR EVs組小鼠顯示出更高水平的心肌酶（圖2h）。這些結(jié)果表明IR EVs加重了IR誘導的心臟損傷。
圖2.IR EVs輸血加重IR損傷，促進心臟巨噬細胞M1極化。
[（a）注射IR EV和組織采集的方案示意圖。（b）生物發(fā)光成像證實，通過心臟內(nèi)注射DiR標記的IR EV，IR EV保留在心臟內(nèi)。（c）代表性超聲心動圖。（d）EF值。（e）FS值的統(tǒng)計結(jié)果（n=6）。（f）在IR EVs或PBS輸注后1天處死的小鼠的代表性TTC染色心臟。（g） （f）中梗死面積（以梗死面積（I）/左心室（LV）面積表示）的統(tǒng)計結(jié)果（n=6）。（h）血漿心肌酶水平，包括AST、LDH、CK和CK-MB（n=8,8,12,12）。（i）心臟中NOS2、IL1β、IL6和TNFα的表達。（j）M2極化相關基因Arg1、MRC1、Fizz1和IL10在心臟中的表達。趨化因子包括Ccl2、Ccl4、Cxcl1和Cxcl2在（k）心臟和（l）循環(huán)白細胞中的表達。（m）典型的免疫熒光圖像顯示心臟內(nèi)有CD45+炎性細胞和CD45+F4/80+巨噬細胞。（n）心臟免疫熒光圖像中CD45+炎性細胞（每個區(qū)域的細胞計數(shù)）的統(tǒng)計結(jié)果。（o）心臟免疫熒光圖像中CD45+F4/80+巨噬細胞（每個區(qū)域的細胞計數(shù)）的統(tǒng)計結(jié)果。（p）流式細胞術(shù)測定心臟巨噬細胞極化。（q） 心臟中CD86+M1極化巨噬細胞的百分比。（r）心臟中CD206+M2極化巨噬細胞的百分比，P＜0.05；P＜0.01；P＜0.001；P＜0.0001]
巨噬細胞極化在IR誘導的心臟損傷和修復中起著至關重要的作用。接下來，我們試圖確定IR EVs是否能增強炎癥并調(diào)節(jié)體內(nèi)巨噬細胞的極化。圖2i顯示IR-EV輸血顯著增強了IR損傷心臟中M1極化標記基因NOS2和促炎細胞因子IL1β、IL6和TNFα的表達。而M2極化相關的Arg1、MRC1、Fizz1和IL10的mRNA水平顯著降低（圖2j）。明顯地，IR EVs輸注增強了包括Ccl2、Ccl4、Cxcl1和Cxcl2在內(nèi)的趨化因子在IR損傷小鼠心臟和循環(huán)白細胞中的表達（圖2k和l）。IR EVs不增強促炎因子的表達，如IL1β和IL6（圖S1A和B），但降低IR損傷小鼠循環(huán)白細胞中IL10的表達（圖S1C）。心臟組織的免疫熒光染色顯示，IR-EV輸血促進了假手術(shù)和IR損傷小鼠體內(nèi)CD45+炎性細胞以及CD45+F4/80+巨噬細胞的浸潤（圖2m-o）。先前的研究強調(diào)了Cxcl2在感染期間促進中性粒細胞浸潤的作用（Lentini等人，2020年）。除巨噬細胞外，我們還觀察到用IR EVs治療的IR小鼠中性粒細胞募集增加（圖S2A-C）。流式細胞術(shù)結(jié)果進一步證實，IR EVs增加了假手術(shù)和IR損傷心臟組織中CD86+（M1標記）巨噬細胞的比例，并降低了CD206+（M2標記）巨噬細胞的百分比（圖2p-r）。這些結(jié)果證實了IR誘導的心臟EV加劇了局部炎癥。值得注意的是，IR EV促進巨噬細胞滲入受損心臟，并在心臟IR期間促進其M1極化。
3.抑制EV產(chǎn)生可減輕心肌IR損傷并減輕局部炎癥
接下來，我們使用GW4869，一種廣泛使用的EV/外體生物發(fā)生化學抑制劑（Menck等人，2017年；Xiao等人，2018年），探索EV抑制對IR誘導的心臟損傷的影響（圖3a）。首先，我們確認通過腹腔注射GW4869預處理降低了IR誘導的心臟EV生成（補充圖3）。與接受溶媒注射的IR小鼠相比，服用GW4869可顯著改善IR損傷小鼠的心功能（圖3b-d），減少梗死面積（圖3e-f），并降低IR小鼠的心肌酶水平（圖3g）。此外，我們發(fā)現(xiàn)GW4869治療顯著抑制IR損傷心臟中NOS2、IL1β、IL6和TNFα的表達（圖3h），并上調(diào)Arg1、MRC1和Fizz1的水平（補充圖4A-C）。類似地，與IR小鼠相比，經(jīng)GW4869治療的IR小鼠心臟中促炎性趨化因子（包括Ccl2、Ccl4、Cxcl1和Cxcl2）的表達減少（圖3i）。持續(xù)地，GW4869治療減少了IR損傷心臟中CD45+炎性細胞以及CD45+F4/80+巨噬細胞的浸潤（圖3j-l）。GW4869抑制IR-EV的心臟保護作用進一步表明，IR誘導的EV參與心臟IR損傷，并有助于增強炎癥。
圖3.GW4869治療減輕IR損傷并減輕局部炎癥。
[（a）GW4869治療和組織采集的方案示意圖。（b）代表性超聲心動圖，（c）EF值和（d）FS值的統(tǒng)計結(jié)果（n=6）。（e）IR后1天GW4869或DMSO治療小鼠的代表性TTC染色心臟。（f）梗死面積的統(tǒng)計結(jié)果（以梗死面積（I）表示）/左心室（LV）面積（e）（n=6）。（g） 血漿心肌酶水平，包括AST、LDH、CK和CK-MB（n=8、8、12、12）。（h）M1極化相關基因（包括NOS2、IL1β、IL6和TNFα）和（i）促炎癥趨化因子（包括Ccl2、Ccl4、Cxcl1和Cxcl2）在接受GW4869治療的IR小鼠心臟中的表達。（j） 用抗CD45和抗F4/80抗體染色的心臟的代表性免疫熒光圖像。（k） 心臟免疫熒光圖像中CD45+炎性細胞（每個區(qū)域的細胞計數(shù)）的統(tǒng)計結(jié)果。（l） 心臟免疫熒光圖像中CD45+F4/80+巨噬細胞（每個區(qū)域的細胞計數(shù)）的統(tǒng)計結(jié)果。這些數(shù)據(jù)是三次重復的代表性結(jié)果（n=3）。P＜0.05；P＜0.01；P＜0.001；P＜0.000
4.IR-EVs體外編程巨噬細胞向M1樣極化
為了進一步闡明IR-EVs對巨噬細胞極化的作用，應用原代腹腔巨噬細胞并與IR-EVs共培養(yǎng)。首先，添加IR EV促進M1極化相關基因的表達，包括NOS2、IL1β、IL6和TNFα（圖4a和圖S5A和C），并降低M2極化相關基因的表達，如MRC1、Fizz1和IL10（圖4b和圖S5B）。經(jīng)典促炎因子（包括IL1β、IL6和TNFα）的蛋白質(zhì)水平也證實了一致的結(jié)果（圖4c）。在IR-EV刺激24小時后，發(fā)現(xiàn)細胞培養(yǎng)基中IL6的釋放持續(xù)增加（圖S5D）。此外，NOS2（圖4d）、IL1β、IL6和TNFα（圖4e）的mRNA水平隨著EVs在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中濃度的增加而逐漸上調(diào)。此外，我們還探討了IR-EVs對體外產(chǎn)生趨化因子的影響。趨化因子包括Ccl2、Ccl4、Cxcl1和Cxcl2均在mRNA水平顯著增加，尤其是Cxcl2（圖4f和圖S6）。與未治療組相比，高水平IR EV（>109/ml）導致趨化因子的高表達，尤其是Cxcl2（圖4g）。我們的體內(nèi)外結(jié)果表明，IR后大量IR EV的釋放可能是促進趨化因子和炎癥因子產(chǎn)生的驅(qū)動因素之一。此外，IR EVs治療顯著提高了吞噬相關基因的表達（圖4h），并促進了PMφ和BMDM的吞噬活性（圖4i）。
圖4.IR EV促進巨噬細胞M1樣極化。
[經(jīng)IR EVs或PBS過夜處理的巨噬細胞中（a）M1極化相關基因和（b）M2極化相關基因的表達。（c）經(jīng)IR EVs或PBS過夜處理的巨噬細胞分泌IL1β、IL6和TNFα。（d）經(jīng)梯度濃度（0、108、109和1010/ml）處理的巨噬細胞中NOS2的表達）IR電動汽車的一夜之間。（e） IR-EV濃度與經(jīng)IR-EVs處理的巨噬細胞中促炎因子的表達呈正相關。（f） 不同時間（0小時、3小時、6小時、9小時、12小時和24小時）IR EVs處理的巨噬細胞中趨化因子Ccl2、Ccl4、Cxcl1和Cxcl2的表達。（g） 用梯度濃度的IR EVs處理過夜的巨噬細胞，其趨化因子包括Ccl2、Ccl4、Cxcl1和Cxcl2的表達。（h） 不同時間（0小時、3小時、24小時和72小時）IR-EVs處理的巨噬細胞中吞噬相關基因的表達。（i） 吞噬試驗檢測腹腔巨噬細胞（PMφ）和骨髓源性巨噬細胞（BMDM）的吞噬功能。這些數(shù)據(jù)是三次重復的代表性結(jié)果（n=3）。P＜0.05；P＜0.01；P＜0.001；P＜0.0001]
5.miR-155-5p作為IR-EV介導巨噬細胞極化的候選效應物
電動汽車通過提供miRNA而被稱為細胞間通信載體。因此，我們對來自假手術(shù)（S-EVs）和IR損傷心臟的EV進行RNA序列分析，以確定候選的miRNA效應子。鑒定了差異表達的miRNA（圖5a和表S3），IR EV中前面10個高表達的miRNA也通過qPCR進行了驗證，包括miR-155-5p、miR-484、miR-7a-5p、miR-132-3p、miR-181d-5p、miR-432-5p、miR-652-3p、miR-15b-5p和2個新的miRNA:miR-novel-chr7_40384和miR-novel-chr7_40362（圖5b）。共聚焦顯微鏡的結(jié)果顯示IR EV可被巨噬細胞攝取，這始終體現(xiàn)了載體特性（圖5c）。為了進一步確定IR EV介導的巨噬細胞極化的候選miRNA，在與IR EVs共培養(yǎng)的PMφ中檢測前三個高表達miRNA（miR-155-5p、miR-484和miR-novelR-CHR740384）。值得注意的是，與S-EV培養(yǎng)的巨噬細胞相比，IR-EV培養(yǎng)的巨噬細胞中miR-155-5p顯著上調(diào)（圖5d）。此外，IR EVs的濃度與共培養(yǎng)巨噬細胞中miR-155-5p的表達呈正相關（圖5e和f）。有趣的是，高濃度的IR EV（1010/ml）同時增加了pri-mir155的表達（圖5g）。一致地，我們進一步發(fā)現(xiàn)，與循環(huán)假EV相比，循環(huán)IR EV中高濃度的miR-155-5p（補充圖7a）。心臟IR EV中的低表達miRNA，如miR-9-5p和miR-151-3p，在循環(huán)IR EV中也減少（圖S7B和C）。因此，miR-155-5p可作為IR EVs中關鍵監(jiān)管貨物的有力候選。
圖5.MiR-155-5p可以從IR EV轉(zhuǎn)移到巨噬細胞。
[（a）熱圖顯示S-EV和IR-EV之間差異表達的miRNA。（b）通過qPCR驗證IR-EV中顯著高表達的miRNA。（c）共聚焦圖像顯示PMφ在與DiI標記的EV共培養(yǎng)24小時后攝取IR-EV。（d）qPCR用于評估3種富含IR-EV的miRNA的表達，包括經(jīng)PBS、S-EVs或IR-EVs處理不同時間（0小時、3小時、24小時和72小時）的PMφ中的miR-484、miR-155-5p和一種新的miRNA（miR-novel）。（e） 增加IR EV濃度可導致經(jīng)治療巨噬細胞中miR-155-5p的劑量依賴性增加。（f） IR-EV濃度與IR-EV處理的巨噬細胞中miR-155-5p的表達呈正相關。（g） pri-mir155在梯度濃度IR EVs處理24小時后巨噬細胞中的表達。這些數(shù)據(jù)是三次重復的代表性結(jié)果（n=3）。P＜0.05；P＜0.01；P＜0.001；P＜0.0001]
6.IR EVs中的miR-155-5p通過JAK2/STAT1途徑促進巨噬細胞M1極化
除了在與IR EV共培養(yǎng)的PMφ中顯著增加NOS2表達外，我們進一步證實IR-EV濃度與NOS2表達之間存在正相關性（圖6a）。同時，在IR-EV-共培養(yǎng)巨噬細胞中，miR-155-5p表達與NOS2表達呈正相關（圖6b）。miR-155-5p模擬物的轉(zhuǎn)染增加了促炎因子的表達（圖6c-e），并降低了抗炎細胞因子IL10的表達（圖6f）。此外，心內(nèi)注射agomiR-155可復制IR EVs的促炎癥作用，增加IR損傷心臟中IL1β、IL6和TNFα的表達（圖6g-i），降低IL10的表達（圖6j）。先前的研究表明JAK/STAT1是巨噬細胞M1極化的重要調(diào)節(jié)途徑（Jin等人，2020年；墨爾本等人，2020年）。如圖6k和l所示，IR EVs顯著提高PMφ中總JAK2和磷酸化JAK2（p-JAK2）的表達。下游分子STAT1在IR-EV-共培養(yǎng)巨噬細胞中也被激活。類似地，添加miR-155-5p模擬物激活巨噬細胞中的JAK2/STAT1通路（圖6m和n）。此外，miR-155-5p模擬物進一步增強IR EV誘導的JAK2/STAT1激活，miR-155-5p抑制劑抵消了巨噬細胞中IR EV誘導的p-JAK2和p-STAT1蛋白的升高（圖6o和p）。這些結(jié)果表明，miR-155-5p通過JAK2/STAT1激活促進IR-EV調(diào)節(jié)的巨噬細胞M1極化。
圖6.miR-155-5p通過激活JAK2/STAT1通路促進M1極化。
[（a）IR-EV處理的巨噬細胞中IR-EV濃度與NOS2表達呈正相關。（b）IR-EV處理的巨噬細胞中miR-155-5p表達與NOS2表達呈正相關。促炎因子（c）IL1β，（d）IL6，（e）TNFα和（f）的表達用miR-155-5p模擬物處理PMφ中的IL10。體內(nèi)給予agomiR-155可增加IR損傷心臟中促炎細胞因子（g）IL1β，（h）IL6，（i）TNFα的表達，并降低抗炎細胞因子（j）IL10的表達。（k） Western印跡證實，IR-EV（0、108、109和1010/ml）處理可激活JAK2和STAT1蛋白。（l） （k）中免疫印跡條帶強度的量化數(shù)據(jù)。（m） 通過western blot評估，巨噬細胞中MiR-155-5p（0，100200，500 nM）過表達激活JAK2和STAT1蛋白。（n） 免疫印跡條帶強度的定量數(shù)據(jù)（m）。（o） Western blotting證實miR-155-5p模擬物進一步增強IR EVs誘導的JAK2/STAT1激活，miR-155-5p抑制劑抵消了巨噬細胞中IR EVs誘導的p-JAK2和p-STAT1蛋白的升高。（p） （o）中免疫印跡條帶強度的量化數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)是三次重復的代表性結(jié)果（n=3）。P＜0.05；P＜0.01；P＜0.001；P＜0.0001]
7.IR EV可導致遠處器官的全身炎癥
為了進一步探索IR EV是否在其他器官發(fā)揮作用，我們首先確認心肌IR損傷觸發(fā)循環(huán)中EV釋放增加（圖S8A）。此外，IR損傷促進了IR后1天循環(huán)中促炎細胞因子（IL1β和IL6）和趨化因子（Cxcl1和Cxcl2）的分泌（圖7a）。除心臟組織外，在遠處器官，包括肺、肝、腎和脾，促炎基因的表達也增加（圖7b）。此外，GW4869治療減少了IR損傷小鼠循環(huán)中促炎細胞因子（IL1β和IL6）和趨化因子（Cxcl1和Cxcl2）的釋放（圖7c），并減少了遠端器官中由心肌IR誘導的促炎基因的表達（圖7d）。至于腦組織，心臟IR損傷僅造成微弱的促炎作用（圖S8B），我們在IR損傷小鼠的大腦中未發(fā)現(xiàn)GW4869治療的顯著抗炎作用（圖S8C）。
圖7.IR EV可引發(fā)遠處器官的全身炎癥。
[（a）心肌IR損傷促進血液中促炎細胞因子（IL1β和IL6）和趨化因子（Cxcl1和Cxcl2）的分泌。（b）心肌IR損傷誘導遠處器官中促炎基因表達增加。（c）GW4869治療減少促炎細胞因子（IL1β和IL6）和趨化因子的釋放（Cxcl1和Cxcl2）在IR損傷小鼠的循環(huán)中。（d） GW4869治療可降低遠端器官心肌IR誘導的促炎基因的表達。（e） 生物發(fā)光成像顯示靜脈注射DiR標記的EVs后24小時IR-EVs在器官間的分布。（f） 靜脈注射100μL IR EVs（0.4μg/μL）或PBS后24小時血液中促炎細胞因子（IL1β和IL6）和趨化因子（Cxcl1和Cxcl2）的分泌。（g） 靜脈注射100μL IR EVs（0.4μg/μL）或PBS后24小時循環(huán)白細胞中促炎基因的表達。（h） 靜脈注射100μL IR EVs（0.4μg/μL）或PBS后24小時，促炎基因在不同器官中的表達。這些數(shù)據(jù)是三次重復的代表性結(jié)果（n=3）。P＜0.05；P＜0.01；P＜0.001；P＜0.0001]
最近的研究強調(diào)EV是不同病理過程中的遠端調(diào)節(jié)分子（Thomou等人，2017年；Whitham等人，2018年）。生物發(fā)光成像證實，在向正常小鼠靜脈注射DiR標記的EV 24小時后，IR EV存在于各種器官中（圖7e和圖S8d）。接下來，我們證明靜脈注射IR EVs可增加循環(huán)中促炎細胞因子（IL1β和IL6）和趨化因子（Cxcl1和Cxcl2）的釋放（圖7f）。靜脈注射IR EVs后，循環(huán)白細胞中促炎基因的表達也升高（圖7g）。一致地，通過靜脈注射IR EVs在不同器官中發(fā)現(xiàn)類似的促炎作用（圖7h和圖S8E）。此外，IR EV的施用上調(diào)了多個器官中CD45+和CD45+F4/80+細胞的表達，尤其是在EV富集的器官中，如肺和肝（圖S9）。這些發(fā)現(xiàn)表明，IR EV在心臟IR損傷期間促進全身炎癥反應。
總結(jié)
心肌IR引起心臟EV的大量釋放。這些IR誘導EV（IR EV）促進IR損傷心臟的局部無菌性炎癥，并可通過引發(fā)全身炎癥的循環(huán)分流至遠處器官。值得注意的是，IR EVs可將miR-155-5p輸送至巨噬細胞，并通過激活JAK2/STAT1通路促進促炎癥表型。GW4869抑制EV可降低局部和全身炎癥，并顯著減輕IR誘導的心臟損傷。
圖8.IR誘導的EV在心肌IR損傷中的作用示意圖。
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