一、蛋白提取 樣本制備是WB實(shí)驗(yàn)的第一步也是最重要的一步，它的操作雖然并不復(fù)雜，卻有很多需要注意的細(xì)節(jié)。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要的目標(biāo)蛋白的不同，大致可以分為三種：總蛋白、膜蛋白和核蛋白?？偟鞍滋崛☆櫭剂x就是把組織或細(xì)胞內(nèi)所有的蛋白全都提取出來(lái)；膜蛋白、核蛋白提取簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)就是把細(xì)胞膜、細(xì)胞核上的蛋白質(zhì)提取出來(lái)。 
提取流程概覽
不同部位的蛋白要能夠提取分離，需要用到不同的提取試劑，看起來(lái)十分麻煩，愛必信的蛋白抽提試劑盒（abs9346）提供了一種比較簡(jiǎn)單、方便的從培養(yǎng)細(xì)胞或新鮮組織中抽提細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞漿蛋白、細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞骨架蛋白的方法。約90分鐘就可以完成培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞漿蛋白、細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞骨架蛋白的分離。 | 貨號(hào) | 名稱 | 組份 | | abs9346-50T | 蛋白抽提試劑盒 | 胞漿蛋白提取液60mL
胞核蛋白提取液10mL
膜蛋白提取液6mL
結(jié)構(gòu)蛋白提取液6mL
磷酸酶抑制劑II（50×）1mL
PMSF（100×） |
二、常見問題&解決策略
Q1 蛋白信號(hào)弱甚至無(wú)信號(hào)
在應(yīng)用裂解液進(jìn)行裂解的時(shí)候，除了釋放出目標(biāo)蛋白，也同時(shí)釋放出一些酶，這些酶可能會(huì)降解我們的目標(biāo)蛋白，所以需要對(duì)這部分酶進(jìn)行降解。 添加合適的蛋白酶抑制劑（abs9161）或磷酸酶抑制劑（abs9162），全程低溫操作，提前預(yù)冷PBS（abs961）、裂解液甚至槍頭等，從收集細(xì)胞開始一直到煮樣的全過程都應(yīng)該盡可能的保持在冰上操作。
蛋白酶/磷酸酶抑制劑推薦
| 貨號(hào) | 名稱 | 推薦濃度 | 規(guī)格 | | abs9161 | 廣譜型蛋白酶抑制劑混合物 (不含EDTA,100×DMSO儲(chǔ)液) | 與樣品比例：1:100 | 1ml | | abs9162 | 廣譜型磷酸酶抑制劑混合物 (100×儲(chǔ)液)(水) | 與樣品比例：1:100 | 1ml 5*1ml |
如果實(shí)驗(yàn)過程中需要這部分酶和一些小分子蛋白，在選擇裂解液的時(shí)候也要選擇沒有抑制劑的裂解液（abs9231和abs9239）
樣品中不含待測(cè)蛋白，有太多可能性，對(duì)蛋白定位不準(zhǔn)確，采用了錯(cuò)誤的提取方法。
找準(zhǔn)蛋白定位，是否需要保留蛋白的天然結(jié)構(gòu)，如果需要的話在選擇裂解液的時(shí)候要選擇不含去垢劑或者含少量Triton-X-100的裂解液（abs9230）；不需要的話可能是RIPA試劑的濃度沒有調(diào)配好，或者選擇了不合適強(qiáng)度的RIPA。
常規(guī)裂解液對(duì)比表
| 產(chǎn)品貨號(hào) | abs9229 | abs9231 | abs9228 | abs9230 | | 產(chǎn)品名稱 | RIPA裂解液（強(qiáng)） | RIPA裂解液（強(qiáng)）(不含抑制劑) | RIPA裂解液（中） | RIPA裂解液（弱） | | 有效成分 | 1% Triton X-100，1%脫氧膽酸鈉，0.1% SDS | 1% Triton X-100,1%脫氧膽酸鈉，0.1% SDS | 1% NP-40，0.5%脫氧膽酸鈉，0.1% SDS | 1% NP-40，0.25%脫氧膽酸鈉 | | 裂解強(qiáng)度 | 強(qiáng) | 強(qiáng) | 中 | 溫和 | | 對(duì)膜蛋白的提取 | 優(yōu)秀 | 優(yōu)秀 | 良好 | 一般 | | 對(duì)胞漿蛋白的提取 | 優(yōu)秀 | 優(yōu)秀 | 優(yōu)秀 | 優(yōu)秀 | | 對(duì)核蛋白的提取 | 優(yōu)秀 | 優(yōu)秀 | 良好 | 較好 | | 胞漿磷酸化蛋白的提取 | 優(yōu)秀 | 優(yōu)秀 | 優(yōu)秀 | 優(yōu)秀 | | 核轉(zhuǎn)錄因子的提取 | 優(yōu)秀 | 優(yōu)秀 | 優(yōu)秀 | 優(yōu)秀 | | 蛋白酶抑制劑 | 含有 | 不含 | 含有 | 含有 | | 磷酸酶抑制劑 | 含有 | 不含 | 含有 | 含有 | | 主要用途 | WB，IP | WB，IP | WB，IP | WB，IP，Co-IP |
如果您覺得裂解液的選擇太麻煩，愛必信為您精心準(zhǔn)備了免疫印跡及免疫沉淀用裂解液（abs9116，abs9239{不含抑制劑}），這兩款產(chǎn)品的濃度是經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證調(diào)配出的最佳濃度，幾乎適用于90%的樣本制備，讓您的樣本制作更輕松。
裂解液推薦
| 貨號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 強(qiáng)度 | 蛋白定位 | 規(guī)格 | | abs9116 | WB/IP細(xì)胞裂解液 | 溫和 | 全細(xì)胞/膜/核 | 100ml | | abs9239 | WB/IP細(xì)胞裂解液(無(wú)抑制劑) | 溫和 | 全細(xì)胞/膜/核 | 100ml |
* 樣品蛋白含量低 * 去除高豐度蛋白，富集低豐度目的蛋白
Q2、蛋白成坨吸不上來(lái)，電泳條帶形狀不好
SDS LB不夠，樣品核酸、蛋白濃度過高 ①再煮5min。常規(guī)煮樣時(shí)間3-5min，樣品過濃時(shí)就煮10min；
②如果10min煮樣后，仍然吸不起來(lái)，才適當(dāng)增加SDS LB，繼續(xù)煮；
③也可以對(duì)樣品進(jìn)行超聲。 煮樣不能過久，容易造成蛋白凝固，出現(xiàn)沉淀和水分離，只能丟棄。
Q3、出現(xiàn)多帶現(xiàn)象
* 細(xì)胞傳代次數(shù)過多，使其蛋白表達(dá)不同
* 使用原始未傳代的細(xì)胞株，做對(duì)照實(shí)驗(yàn)
* 蛋白具有多種修飾形式，可能存在糖基化、磷酸化、羥基化
* 去磷酸化、去糖基化來(lái)驗(yàn)證翻譯后的修飾
* 蛋白樣本降解
* 加抑制劑、冰上操作
蛋白樣品的制備是整個(gè)WB實(shí)驗(yàn)最初的一步也是最關(guān)鍵的一步，選對(duì)試劑找對(duì)方法至關(guān)重要，愛必信將不斷探索與開發(fā)優(yōu)良的試劑，為您的實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航。
Absin特色產(chǎn)品線(全部現(xiàn)貨)：
WB相關(guān)：ECL發(fā)光液、預(yù)染marker、預(yù)制膠；IHC相關(guān)：二抗試劑盒、組化筆；IP/CoIP試劑盒；激動(dòng)劑/抑制劑；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡試劑盒；呼吸爆發(fā)試劑盒；ELISA試劑盒；重組蛋白；抗體: 二抗、標(biāo)簽抗體、對(duì)照抗體；定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))... |
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