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細(xì)胞被支原體污染后會(huì)引起：

細(xì)胞生長特征的改變，細(xì)胞代謝的抑制；

核酸合成的破壞，染色體畸變；

細(xì)胞膜抗原性的改變，并可能改變轉(zhuǎn)染率和病毒敏感性。

但是細(xì)胞的生長率一般并未發(fā)生顯著的影響，因而細(xì)胞被支原體污染一般難以察覺。

因此支原體的定期檢測、及早發(fā)現(xiàn)及清除對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)尤其是非常重要的細(xì)胞極為重要。

3.支原體檢測方法

細(xì)胞培養(yǎng)中有幾種不同的技術(shù)可以識(shí)別是否被支原體污染，分別是分離培養(yǎng)法，DNA熒光染色檢測法，ELISA檢測法，PCR檢測法和支原體特異酶檢測法。為給大家提供一個(gè)選擇參考，小優(yōu)這就詳細(xì)介紹下這幾種方法的優(yōu)缺點(diǎn)。

分離培養(yǎng)法

操作方法：

從可疑的細(xì)胞培養(yǎng)體系中取樣，并接種到最適宜支原體生長的瓊脂平板上。如果樣本中含有支原體，它們就會(huì)在這種瓊脂平板上快速生長，最終形成明顯可見的特征性菌落。

分離培養(yǎng)法是支原體檢測的金標(biāo)準(zhǔn)方法，基本不會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果，其檢測精確度最高，具有高度的特異性和敏感性，可檢測絕大多數(shù)支原體種類。但支原體雖能在人工培養(yǎng)基上生長，但對(duì)培養(yǎng)基的營養(yǎng)要求較高，培養(yǎng)基較為復(fù)雜。而且檢測時(shí)間太長，支原體要長出明顯克隆至少需要4周時(shí)間，若檢測到有支原體，細(xì)胞的污染范圍也已經(jīng)擴(kuò)大了，現(xiàn)在用此方法檢測的比較少。

 
DNA熒光染色檢測法

操作方法：

1、細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備： 

（1）對(duì)于貼壁細(xì)胞，在六孔板或其它多孔板內(nèi)或蓋玻片上培養(yǎng)細(xì)胞至 50%-80%。細(xì)胞培養(yǎng)過滿會(huì)導(dǎo)致很難判斷是否存在支原體污染。 

（2）對(duì)于懸浮細(xì)胞，離心沉淀細(xì)胞，取少量細(xì)胞做細(xì)胞涂片，空氣中充分晾干。 

2、用 PBS 按照 1:10 稀釋 Hoechst 染色液(1 體積 Hoechst 染色液加入 9 體積 PBS)。稀釋后的 Hoechst 染色液宜在 24h 內(nèi)使用。 

3、加適量固定液固定 10~20min。 對(duì)于六孔板的一個(gè)孔，加入 1mL 固定液。確保固定液充分覆蓋樣品，固定前切勿對(duì)細(xì)胞進(jìn) 行洗滌。對(duì)于貼壁細(xì)胞，固定前需去除培養(yǎng)液。 

4、去除固定液，空氣中晾干。 

5、加適量 10 倍稀釋的 Hoechst 染色液室溫染色 10~30min。 對(duì)于六孔板的一個(gè)孔，加入 1mL 染色液。確保染色液充分覆蓋樣品，染色時(shí)注意避光?？梢杂娩X箔紙避光。 

6、去除染色液，空氣中晾干。 

7、滴加試劑盒中提供的抗熒光淬滅封片液，封片后熒光顯微鏡下觀察藍(lán)色熒光。 熒光顯微鏡觀察時(shí)需 400 倍或 1000 倍放大觀察(需使用油鏡)。 沒有支原體污染或其它原核生物污染的細(xì)胞樣品，僅觀察到細(xì)胞核的藍(lán)色熒光，線粒體 DNA 不會(huì)被染色。 

有支原體污染的細(xì)胞樣品可觀察到細(xì)胞核周圍微粒狀或絲狀藍(lán)色熒光。 支原體污染嚴(yán)重的細(xì)胞可以觀察到大量微粒狀或絲狀藍(lán)色熒光。

培養(yǎng)細(xì)胞中的細(xì)菌污染、酵母污染或霉菌污染都在光學(xué)顯微鏡下可見，但支原體污染在光學(xué)顯微鏡下不可見，通過Hoechst染色來檢測支原體，可快速、有效、高靈敏度地檢測支原體污染。但是Hoechst 染色試劑對(duì)人體有害，要注意防護(hù)；且固定液含有冰乙酸，有刺激性氣味，需要在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行固定操作；熒光染料都存在淬滅的問題，建議染色后盡量當(dāng)天完成檢測。

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ELISA檢測法

以ELISA法為基礎(chǔ)的支原體檢測一般使用針對(duì)支原體16S rRNA基因的帶標(biāo)記探針或抗體，也有一些商品化的支原體elisa試劑盒來檢測培養(yǎng)物中是否含有支原體。不過這種方法相對(duì)復(fù)雜市面上用的也比較少。

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PCR檢測法

PCR法采用針對(duì)支原體DNA的引物用PCR檢測可疑樣本，可擴(kuò)增樣品中DNA的特定序列，其中PCR引物通常針對(duì)支原體的16S rRNA基因。在凝膠電泳過程中，支原體DNA會(huì)顯示為特異性條帶，以此指示支原體的存在。

PCR檢測法是一種靈敏而快速的方法，可以在4.5 h–1天內(nèi)識(shí)別細(xì)胞培養(yǎng)物中的支原體污染，在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室也廣泛使用。但是，存在在測試過程中將污染物從陽性對(duì)照（或以前對(duì)支原體測試呈陽性的任何樣品）傳播到未受影響的樣品的風(fēng)險(xiǎn)，從而導(dǎo)致假陽性結(jié)果，許多商品化的試劑盒也無法檢測所有種類的支原體。另外PCR的擴(kuò)增會(huì)被細(xì)胞的代謝產(chǎn)物抑制，需要用DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取后再進(jìn)行鑒定。 

支原體特異酶檢測法

操作方法：

1、取2mL培養(yǎng)基上清（建議培養(yǎng)48小時(shí)以上），200g離心5分鐘，去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片；

2、取100μL上清，加入100μL裂解試劑（MycoAlert PLUS Reagent，含裂解試劑、熒光素酶、熒光素），裂解支原體；

3、室溫22℃（不超過25℃）孵育5分鐘，檢測背景ATP，測量發(fā)光值得到讀數(shù)A（Reading A）；

4、加入100μL支原體酶特異性底物（MycoAlert PLUS Substrate）；

5、室溫孵育10分鐘，測量發(fā)光值得到讀數(shù)B（Reading B），計(jì)算B/A比值。

若B/A比值小于0.9則為支原體陰性，若B/A比值大于1.2則為支原體陽性，若介于兩者之間則為結(jié)果可疑，需要繼續(xù)培養(yǎng)24h后復(fù)檢。

支原體特異酶檢測法主要是Lonza品牌的MycoAlert™方法，首先溶解支原體細(xì)胞，釋放其酶。這些酶與試劑盒中的底物發(fā)生反應(yīng)，催化ADP向ATP的轉(zhuǎn)化。螢光素酶使用此ATP來創(chuàng)建光信號(hào)，然后可以使用發(fā)光計(jì)對(duì)其進(jìn)行檢測，通過檢測底物加入前后讀數(shù)的比值，可判斷樣本中是否含有支原體。

該法為化學(xué)發(fā)光，操作簡單，無需提取DNA，快速檢測，20分鐘內(nèi)出結(jié)果，具有較高的靈敏度、特異性及相對(duì)較高的準(zhǔn)確性，已驗(yàn)證可檢測至少44種支原體，包含細(xì)胞培養(yǎng)中常見的6種支原體（口腔支原體、精氨酸支原體、豬鼻支原體、萊氏無膽甾原體、發(fā)酵支原體、唾液支原體，占支原體污染的95%），既可以檢測新鮮樣本也可以檢測凍存樣本，可以視為常規(guī)微生物培養(yǎng)和DNA熒光染色法的替代方法。

測定方法必然是高靈敏、高特異性且快速的。但目前沒有一種非常好的檢測方法可以單槍匹馬把實(shí)驗(yàn)室污染細(xì)胞的八種主要支原體都檢測出來。大家可以根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)需求選擇相應(yīng)的產(chǎn)品，也可以結(jié)合使用兩種方法對(duì)支原體進(jìn)行鑒定以獲得可靠的檢測結(jié)果。

4.支原體清除

當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中存在支原體污染后，如果是不太重要或者有備份的細(xì)胞，可將培養(yǎng)物與用過的培養(yǎng)基滅活后丟棄即可。但對(duì)于珍貴的細(xì)胞就要選擇支原體清除試劑來處理細(xì)胞，并結(jié)合抗生素以*清除支原體來拯救比較重要的細(xì)胞樣品。

這里推薦Lonza的MycoZap廣譜支原體清除試劑，使用簡單，只需將支原體清除試劑加入培養(yǎng)基中，細(xì)胞毒性小，不影響細(xì)胞正常生理狀態(tài)，可在4天內(nèi)去除大范圍支原體、無膽甾原體、植物花螺原體等柔膜菌綱物種；隨后的4-6周內(nèi)，可以再用Lonza MycoAlert支原體檢測試劑盒進(jìn)行不間斷檢測，以確保后續(xù)培養(yǎng)物不被污染。

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5.支原體預(yù)防

支原體非常頑強(qiáng)，盡管有可清除的試劑，對(duì)支原體污染的預(yù)防工作也是非常有必要的。主要可從以下幾個(gè)方面：

首先規(guī)范細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)始終是預(yù)防支原體感染的最佳方式，如細(xì)胞培養(yǎng)工作中多注意控制環(huán)境污染、嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)操作、細(xì)胞培養(yǎng)基和器材要保證無菌以及在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入適量的抗生素等；

其次搭配使用預(yù)防試劑，如Lonza MycoZap支原體預(yù)防試劑特異性預(yù)防支原體污染的抗生素，其中MycoZap Plus可預(yù)防包括支原體、革蘭氏陽xing菌、革蘭氏陰性菌、真菌、酵母在內(nèi)的多種微生物污染，其配方也根據(jù)細(xì)胞系、原代細(xì)胞進(jìn)行了特殊優(yōu)化。

最后定期檢測也很重要，支原體感染會(huì)使培養(yǎng)細(xì)胞慢慢枯萎，將定期支原體檢測常規(guī)化堅(jiān)持下去，也是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)支原體感染的關(guān)鍵。

建議檢測頻率

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談到支原體污染，小優(yōu)還特別邀請(qǐng)到了Lonza資深應(yīng)用技術(shù)專家做一場線上講座：

主題：支原體對(duì)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的危害及快速檢測方法介紹

時(shí)間： 2021.6.7 周一16:00-17:00

地點(diǎn)：小優(yōu)博士（小程序）

方式：直播+回放，可預(yù)約提醒

講座主要內(nèi)容

• 什么是支原體污染，支原體污染對(duì)實(shí)驗(yàn)影響的統(tǒng)計(jì)情況

• MycoAlert快速支原體檢測方法介紹

• 搭配Lucetta2.0的支原體檢測實(shí)驗(yàn)流程

除了支原體污染相關(guān)的講座，近期小優(yōu)攜手Lonza品牌開展了一系列的線上講座，敬請(qǐng)關(guān)注。

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