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細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)檢查

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細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)檢查

(一)一般形態(tài)觀察

生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞在普通顯微鏡下觀察時(shí)可見(jiàn),細(xì)胞透明度大,輪廓不清,只有用相差顯微鏡觀察,才能看清細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)。細(xì)胞內(nèi)顆粒少、無(wú)空泡,胞膜清晰,培養(yǎng)上清液清澈透明,看不到懸浮細(xì)胞和碎片;細(xì)胞功能不良時(shí),輪廓增強(qiáng),胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物,細(xì)胞之間空隙加大,細(xì)胞形態(tài)可變得不規(guī)則,甚至失去原有特點(diǎn)。只有生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞才能用于實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中,CO2積累增多,由于培養(yǎng)液內(nèi)含有pH指示劑,因此其顏色變化可間接反映細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。正常情況下,培養(yǎng)液呈桃紅色;呈橙黃色時(shí),細(xì)胞一般生長(zhǎng)狀態(tài)較好;呈淡黃色,則可能是培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)不足、細(xì)胞死亡過(guò)多;呈紫紅色,則可能是細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不好,或已死亡。

(二)細(xì)胞增殖生長(zhǎng)狀態(tài)

初代或傳代培養(yǎng)時(shí),都有一長(zhǎng)短不同的潛伏期。傳代細(xì)胞系、胚胎組織或幼體組織潛伏期短,一般在第二天即可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng),一周內(nèi)便可連接成片。成體組織的潛伏期長(zhǎng),老齡組織和癌組織更長(zhǎng),有時(shí)可達(dá)一周左右。

初代組織塊培養(yǎng)法細(xì)胞生長(zhǎng),zui先從組織“長(zhǎng)”出的為游走細(xì)胞,它們多單獨(dú)活動(dòng),形態(tài)不規(guī)則,用縮時(shí)逐格顯微攝電影法可顯示出極活躍的變形、游走和吞噬活動(dòng)。在游走細(xì)胞之后,接著長(zhǎng)出的是成纖維細(xì)胞或上皮細(xì)胞。只有當(dāng)出現(xiàn)細(xì)胞分裂、細(xì)胞數(shù)量逐漸增多、形成較大生長(zhǎng)暈或連接成片時(shí),細(xì)胞才真正進(jìn)入增殖狀態(tài)。成纖維細(xì)胞是zui易生長(zhǎng)細(xì)胞,生長(zhǎng)速度較快,低倍鏡下觀察時(shí),前哨部位細(xì)胞似火焰狀或放射形狀向外擴(kuò)展;如接種為游走細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞,在密度不大時(shí),可連接成網(wǎng)狀,只有細(xì)胞密度增大時(shí)才連接成片。

上皮細(xì)胞排列緊密,相互接壤成膜狀;上皮膜邊緣整齊,細(xì)胞很少單獨(dú)活動(dòng),生長(zhǎng)時(shí)整個(gè)上皮膜發(fā)生移動(dòng)。上皮細(xì)胞尤其是外胚層來(lái)源的細(xì)胞如表皮細(xì)胞等,生長(zhǎng)過(guò)程中常產(chǎn)生溶解酶,能使細(xì)胞間質(zhì)發(fā)生液化,導(dǎo)致細(xì)胞相互分離,嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞脫落,其確切機(jī)制尚不明了.可能與產(chǎn)生透明質(zhì)酸酶有關(guān)。

細(xì)胞接種后,經(jīng)過(guò)懸浮期、潛伏期和指數(shù)增生期等后,zui終將長(zhǎng)滿瓶壁,如不及時(shí)做再培養(yǎng),由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗和代謝產(chǎn)物積累,細(xì)胞即進(jìn)入停滯期。此時(shí)細(xì)胞輪廓增強(qiáng),細(xì)胞內(nèi)常出現(xiàn)前述有膨脹線粒體形成的堆積物,細(xì)胞變得粗糙,嚴(yán)重時(shí)細(xì)胞從瓶壁脫落,只有及時(shí)做傳代,才能使細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)。

(三)微生物污染

在長(zhǎng)時(shí)間反復(fù)培養(yǎng)過(guò)程中,即使細(xì)胞培養(yǎng)用品消毒操作嚴(yán)密,也會(huì)偶爾發(fā)生細(xì)菌、支原體、真菌、病毒和其他雜質(zhì)細(xì)胞污染,需隨時(shí)注意,一旦發(fā)生污染,應(yīng)及時(shí)進(jìn)行處理。

(四)培養(yǎng)液

在正常情況下,培養(yǎng)液pH介于7.2~7.4,呈紅色。用一般培養(yǎng)箱培養(yǎng)時(shí),隨細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間延長(zhǎng),CO2積累增多,在超過(guò)緩沖范圍之后,營(yíng)養(yǎng)液酸化逐漸變黃色,這時(shí)如不
及時(shí)調(diào)節(jié)pH,會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不利影響,嚴(yán)重時(shí)可使細(xì)胞退變死亡。培養(yǎng)液中加N-(2-羥乙基)N’-2-乙烷磺酸(N-2 Hydroxyethylpiperazme-N’-2-ethanesulionicacid,HEPES)或用5%CO2溫箱培養(yǎng)可使pH維持穩(wěn)定。用含磷酸鹽緩沖系統(tǒng)培養(yǎng)液時(shí),可因瓶口漏氣,CO2溢出,也可能由于培養(yǎng)瓶塞洗刷不潔,殘留堿性物質(zhì)所致,使之變?yōu)閴A性而呈紅色。更換營(yíng)養(yǎng)液的時(shí)間,可依據(jù)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗而定,細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛時(shí),2~3d更換一次;生長(zhǎng)緩慢時(shí),3~4d更換為宜。需特別注意,各種細(xì)胞對(duì)pH的要求不同。

 

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