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由于沒有考慮到使用一些可以替代的辦法，目前還有傳統(tǒng)做法仍然存在于HPLC的技術(shù)應(yīng)用中，而這些做法其實非常不利于HPLC技術(shù)的效率提高、運行成本的降低以及運行時間的縮短。本文中將提出一些可行的傳統(tǒng)做法的替代方法，有些人可能會對這些替代方法出現(xiàn)爭議，但如果應(yīng)用得當(dāng)?shù)脑?，這些替代方法勢必會產(chǎn)生顯著的效果。因為相比不停地機械勞作，分析科學(xué)家應(yīng)該更聰明地工作。

 

常見錯誤之一——色譜柱用粒徑5µm的顆粒填充

回想一下，多年來標(biāo)準(zhǔn)HPLC分析柱(250mm×4.6mm)都是采用5µm 粒徑顆粒填裝的，然而，事實上3µm 粒徑顆粒填裝的色譜柱(150mm×4.6mm)具有更好的分離效果及更短的分析時間。同時，現(xiàn)在許多實驗室標(biāo)配的色譜儀是超高壓液相色譜(UHPLC)和液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)，所以色譜柱更應(yīng)該換成3µm 或2µm 填裝的色譜柱。

值得注意的是：3µm 粒徑顆粒填裝的色譜柱進(jìn)口孔隙更小，更容易被“臟”的樣品堵塞。

常見錯誤之二——使用4.6mm內(nèi)徑色譜柱(1mL/min)

自20世紀(jì)70年代初，HPLC分析柱的“標(biāo)準(zhǔn)”內(nèi)徑就已經(jīng)是4.6mm了，而近年來，在努力減少溶劑消耗、節(jié)約樣品的目標(biāo)下，許多實驗室已經(jīng)開始將3.0mm內(nèi)徑的色譜柱作為更好的選擇，來代替使用4.6mm內(nèi)徑色譜柱了。如果使用現(xiàn)代的中間分散HPLC的話，柱率和柱外頻帶展寬的效果通常不會受到任何負(fù)面影響?？傊褂幂^小內(nèi)徑的色譜柱是有利的，在梯度洗脫條件下可以獲得更高的分辨率。

常見錯誤之三——對HPLC的流動相進(jìn)行過濾

通常經(jīng)凈化系統(tǒng)所得的HPLC級溶劑和水已經(jīng)足夠干凈了，如果我們再給它一次額外的過濾，那只會適得其反，引入不必要的化學(xué)污染。事實上，許多實驗室都有自己的一套色譜儀器保養(yǎng)維修計劃，每年對HPLC系統(tǒng)中的過濾器進(jìn)行更換，所以我們沒有必要再對流動相進(jìn)一步過濾。

例外的是：如果你使用的是離子對試劑、低純度緩沖劑或高鹽含量的流動相時，仍然強烈建議你對流動相進(jìn)行過濾。

還有一種情況是有必要進(jìn)行額外過濾的，即如果由于水源的質(zhì)量不好或者其他原因?qū)е聫膬艋到y(tǒng)流出的水不夠干凈的時候。

常見錯誤之四——使用緩沖劑流動相

當(dāng)分析酸性或者堿性分析物的時候，有必要對流動相進(jìn)行酸化或者堿化。簡單的流動相如含0.1%(體積比)甲酸的水溶液，僅需要將1mL甲酸定容到1升水中即可迅速制備。同樣，含0.1%(體積比)氨的水溶液可以用于多種高pH值兼容柱。當(dāng)使用低硅羥基活性柱時，無論用低還是高pH值流動相運行，緩沖劑其實都很少用到，包括以流動相A為稀釋劑配制進(jìn)樣樣品溶液時。

例外的是：當(dāng)分析復(fù)雜分子、復(fù)雜混合物時，可能仍然需要用緩沖劑流動相，以保持高的選擇性和特別適中的pH值的流動相。

常見錯誤之五——每次試驗都重新配制新的參考標(biāo)準(zhǔn)溶液

在藥品的質(zhì)量控制實驗室中，往往每個試驗都會重新配制新的參考標(biāo)準(zhǔn)溶液，實際上這是沒有必要的。許多藥物在低溫和適當(dāng)?shù)馁A存條件下溶液具有足夠的穩(wěn)定性。所以你可以一次性配制幾百個合格的參考標(biāo)準(zhǔn)溶液置于HPLC小瓶中，然后冷藏或冷凍貯存供以后分析用。而對于試驗結(jié)果的長期穩(wěn)定性研究來說，更應(yīng)該采用由同一個原始溶液配制而成的標(biāo)準(zhǔn)溶液。當(dāng)然，對于通常的試驗，標(biāo)準(zhǔn)溶液的儲存條件下的穩(wěn)定性(保質(zhì)期)是應(yīng)該經(jīng)過驗證的，并記錄配制時間。這里值得我們注意的是：所有的操作都需要做好記錄。

常見錯誤之六——對樣品瓶進(jìn)行搖動

搖動(或反轉(zhuǎn))樣品瓶會在樣品瓶蓋下面形成一層液體膜，這會對HPLC自動進(jìn)樣器造成干擾以至于給出一個混亂的試驗結(jié)果。所以即使在排除了故障的情況下，也要始終警惕這一點。

例外的是：如果樣品是冷凍過的，那么解凍后，需要進(jìn)行渦旋或搖動以確保樣品均勻。

常見錯誤之七——使用不銹鋼卡套作為柱的接頭

HPLC系統(tǒng)通常安裝有不銹鋼接頭和套圈，大多數(shù)情況下它們工作得都很好，但是它們不適合用于需要頻繁更換色譜柱時的連接。

首先，不銹鋼卡套只能與為其量身定制的端部管接頭相匹配，而對于不同的色譜柱來說這種“量身定制”只會適得其反。

其次，預(yù)制的不銹鋼接頭只能夠重復(fù)密封5-10次。當(dāng)某些制造商的不銹鋼接頭用于其他品牌的色譜柱時，由于不同端部接頭和插入深度的關(guān)系，這個問題會變得尤其明顯。

一個可能的解決方案是使用可以用手指擰緊的聚醚醚酮(PEEK)管件，它們價格低廉，并且在5000psi(34.47MPa)壓力下的密封效果也很好。許多較新的UHPLC接頭，其額定壓力為20,000psi(137.9MPa)，只需用手指擰緊，然后用扳手再轉(zhuǎn)四分之一圈就可以了。