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液相色譜法是20世紀(jì)60年代末在經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種現(xiàn)代色譜分析方法，歷*曾出現(xiàn)過(guò)不同的叫法，如，高壓液相色譜（HPLC）、高速液相色譜（HSLC）和高分辨液相色譜（HRLC）。就分離原理而言，HPLC與經(jīng)典柱層析（色譜）沒(méi)有本質(zhì)的區(qū)別，但由于采用了高壓輸液泵、微粒固定相和高靈敏度檢測(cè)器，HPLC在分析速度、分離效率、檢測(cè)靈敏度和操作自動(dòng)化方面，都達(dá)到了可與GC相比的程度，并保持了樣品適用范圍廣、流動(dòng)相種類多和便于制備的柱層析優(yōu)點(diǎn)，在生物工程、制藥工業(yè)、食品工業(yè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)和石油化工等領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用！

 

HPLC的特點(diǎn)：

①樣品適用范圍廣；

②分離效率高；

③檢測(cè)靈敏度高；

④分析速度快；

⑤樣品回收方便；

液相色譜法的分類：

HPLC的分類方法有多種，比較常見(jiàn)的有三種：

（1）按照分離機(jī)理分類：

①吸附色譜

②分配色譜

③離子交換色譜（IEC）

④體積排阻色譜（SEC）

⑤親和色譜（AC）

（2）按照色譜柱洗脫動(dòng)力學(xué)分類:

①洗脫法

②前沿法

③置換法

（3） 按照分離目的分類：

①分析液相色譜

②制備液相色譜

 HPLC分析常用的樣品處理技術(shù):

粉碎、冷凍干燥、氣體萃取（頂空分析和吹掃-捕集）、溶劑萃?。ɑ亓骰蛩魇陷腿?，加壓溶劑萃?。⒐滔噍腿?、固相微萃取、超臨界流體萃取、微波萃取、超聲波萃取、微透析、衍生化、膜分離、蒸餾、吸附、離心、過(guò)濾、濃縮和溶解等。

色譜定性分析方法

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)照定性；

利用文獻(xiàn)數(shù)據(jù)定性；

利用選擇性檢測(cè)器定性；

在線聯(lián)用儀器定性；

其它定性方法；

液相色譜儀使用及維護(hù)方法

液相色譜儀使用時(shí)要非常注意！

使用卡套柱時(shí)，兩端的卡套應(yīng)時(shí)刻連接在柱芯上。不管您是平衡色譜柱或是清洗，任何時(shí)候都不能將卡套取下來(lái)，否則會(huì)造成填料的流失。 

液相色譜柱使用注意：

卡套柱的安裝（加預(yù)柱）：

將卡套架套入柱芯

將兩片夾套片嵌入柱芯的凹槽，使夾套高于柱芯

將已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高過(guò)夾套片

將“子彈頭”預(yù)柱放入卡套片內(nèi)

將卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手?jǐn)Q緊

然后依同樣的順序連接好柱子的另一端

平衡色譜柱 

反相色譜柱在經(jīng)過(guò)出廠測(cè)試后是保存在乙腈/水中的。請(qǐng)一定確保您所使用的流動(dòng)相和乙腈/水互溶。由于色譜柱在儲(chǔ)存或運(yùn)輸過(guò)程中可能會(huì)干掉，因此在用流動(dòng)相分析樣品之前，應(yīng)使用10～20倍柱體積的甲醇或乙腈平衡色譜柱；如果您所使用的流動(dòng)相中含有緩沖鹽，應(yīng)注意用純水“過(guò)渡”。

硅膠柱或極性色譜柱在經(jīng)過(guò)出廠測(cè)試后是保存在正庚烷中的。如果該色譜柱需要使用含水的流動(dòng)相，請(qǐng)?jiān)谑褂昧鲃?dòng)相之前用乙醇或異丙醇平衡

如何平衡色譜柱？

平衡過(guò)程中，將流速緩慢地提高用流動(dòng)相平衡色譜柱直到獲得穩(wěn)定的基線（緩沖鹽或離子對(duì)試劑度如果較低，則需要較長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)平衡）

色譜柱的再生

進(jìn)行色譜柱再生時(shí)，應(yīng)使用一個(gè)廉價(jià)的泵，我們建議不使用您的液相色譜儀上的泵。 

注意：

在對(duì)NH2改性的色譜柱進(jìn)行再生時(shí)，由于NH2可能成銨根離子的形式存在，因此，應(yīng)該在水洗后用0.1M的氨水沖洗，然后再用水沖洗至堿溶液*流出。如果簡(jiǎn)單的有機(jī)溶劑/水的處理不能夠*洗去硅膠表面吸附的雜質(zhì)，用0.05M稀硫酸沖洗非常有效。

液相色譜的常用術(shù)語(yǔ)

1.色譜曲線（chromatogram）：

在色譜法中，當(dāng)樣品加入后，樣品中各組分隨著流動(dòng)相的不斷向前移動(dòng)而在兩相間反復(fù)進(jìn)行溶解、揮發(fā)，或吸附、解吸的過(guò)程。如果各組分在固定相中的分配系數(shù)（表示溶解或吸附的能力）不同，就有可能達(dá)到分離。

分配系數(shù)小的組分滯留在固定相中的時(shí)間短，在柱內(nèi)移動(dòng)的速度快，先流出柱子；分配系數(shù)大的組分滯留在固定相中的時(shí)間長(zhǎng)，在柱內(nèi)移動(dòng)的速度慢，后流出柱子；分離后的各組分經(jīng)檢測(cè)器轉(zhuǎn)換成電信號(hào)而記錄下來(lái)，得到一條信號(hào)隨時(shí)間變化的曲線，稱為色譜流出曲線或 “色譜峰”，理想的色譜流出曲線應(yīng)該是正態(tài)分布曲線。

2.（色譜）峰（chromatographic peak）：

色譜柱流出組分通過(guò)檢測(cè)器系統(tǒng)時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)的微分曲線。

3.峰底（peak base）：

峰的起點(diǎn)與終點(diǎn)之間的連接的直線。

4.峰高（h，peak height）：

色譜峰zui大值點(diǎn)到峰底的距離。

5.峰寬（W ，peak width）：

在峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作切線與峰底相交兩點(diǎn)的距離。

6.半高峰寬（Wh/2 ，peak with d at half height）：

通過(guò)峰高的中點(diǎn)作平行于峰底的直線，此直線與峰兩側(cè)相交兩點(diǎn)之間的距離（圖1 中的HJ）。

7.峰面積（A ，peak area）：

峰與峰底之間的面積（圖1中的CHEJDC）。

8.拖尾峰（tailing peak）：

后沿較前沿平緩的不對(duì)稱的峰。

9.前伸峰（leading peak）：

前沿較后沿平緩的不對(duì)稱的峰。（又叫伸舌峰、前延峰）

10.假峰（ghost peak）：

除組分正常產(chǎn)生的色譜峰外，由于儀器條件的變化等原因而在譜圖上出現(xiàn)的色譜峰，即并非由試樣所產(chǎn)生的峰。這種色譜峰并不代表具體某一組分，容易給定性、定量帶來(lái)誤差。（又叫鬼峰）

11.畸峰（distrorted peak）：

形狀不對(duì)稱的色譜峰，前伸峰、拖尾峰都屬于這類。 

12.反峰（negative peak）：

也稱倒峰、負(fù)峰，即出峰的方向與通常的方向相反的色譜峰。