酶聯(lián)免疫吸附試驗(enayme liked immunosorbent,ELISA)是20世紀70年代發(fā)展起來的一種檢測技術(shù),因其具有敏感性高、特異性強、操作簡單等優(yōu)點,被廣泛應用于各種抗原和抗體的測定,為輔助診斷與生物科研起到了積極的作用。但在ELISA的測定過程中,影響其測定結(jié)果的因素較多,操作過程每個環(huán)節(jié)都會對試驗結(jié)果產(chǎn)生影響,導致錯誤的測定結(jié)果。

1試劑的準備

　　目前各種ELISA試驗均有商品化的試劑盒。應選擇質(zhì)量優(yōu)良、有批準文號且在有效期內(nèi)的檢測試劑，嚴格按照試劑說明書進行實際操作。從冰箱中取出的試劑應放在室溫下或37℃平衡30min再進行測試。保存試劑盒的冰箱應經(jīng)常檢查儲存溫度并做好記錄，冰箱應避免頻繁開關(guān)。試劑使用前應搖勻。

　　2標本的采集和保存

　　ELISA試驗所用標本主要為血清，也可以用經(jīng)過預處理的唾液、尿液、糞便等生物材料?；颊邩吮究赡芎懈蓴_試驗的免疫物質(zhì)，導致假陽性或者假陰性的結(jié)果，干擾因素一般可分為兩類，即內(nèi)源性和外源性干擾因素。內(nèi)源性干擾因素包括類風濕因子、補體、高濃度的非特異性免疫球蛋白等，避免內(nèi)源性干擾因素主要通過選擇合理的試劑。外源性干擾因素包括標本溶血、標本被細菌污染、儲存時間過長及標本凝固等。在血液采集和運輸過程時，應注意避免溶血[1]。否則，紅細胞溶解時會釋放出血紅蛋白，血紅蛋白中的亞鐵血紅素具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，在以HRP為標記的ELISA試驗測定中，可能會增加非特異性顯色而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。血清標本適宜在新鮮時檢測，若推遲檢測需將標本低溫保存。一般說來，在7天內(nèi)檢測的血清標本，可放置于2℃~8℃保存，超過1周檢測的需低溫冰存。因反復冰融會使抗體效價降低，所以，對需要保存做多次抗體測定的血清標本，應少量分裝并冰存。血清標本應充分離心，否則可因殘留的纖維蛋白原非特異吸附于微孔而造成假陽性結(jié)果。

　　3加樣在ELISA試驗

　　操作中，依次有3次加樣，即加標本、加酶結(jié)合物、加底物。加標本一般采用手工加樣或者加樣器。手工加樣每次必須更換吸嘴，以避免交叉感染。要掌握好并在實際操作中揣摩使用技巧，避免吸樣量過多或過少。加樣器在長時間使用時會因機械磨損或推動桿內(nèi)附著的血痂等原因造成加樣不準，因此必須定期對加樣器進行維護和校準。加酶結(jié)合物和底物一般可直接滴加。每次加樣時，應將所加物置于ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，注意不可濺出，不能產(chǎn)生氣泡，加酶試劑后要用吸水紙在酶標板上輕輕擦拭吸干。加底物操作時應注意各試劑盒顯色劑不能混用，添加順序不能顛倒，不能濺出孔外。標本較多時，需要分批操作，以免加樣板過多，造成加樣后放入孵箱前等待時間過長(尤其是在室溫較高時)。zui后，在微型振蕩器上震蕩lmin，以保證混勻。

　　4溫育

　　ELISA反應是抗原、抗體的結(jié)合在固相表面上發(fā)生的一系列的反應，抗原抗體結(jié)合是一個逐步平衡的過程，需要經(jīng)過擴散才能達到反應的終點，因此ELISA反應需要一定時間的溫育。溫育也是影響檢測結(jié)果的關(guān)鍵因素，尤其是對弱陽性標本影響zui為明顯[2]。溫育方式常采用溫箱法、微波輻射法和水浴法。其中水浴法能較好地解決因受熱不均衡所致的周圍孔與中央孔結(jié)果的吸光度差異(即“邊緣效應”)。溫育常采用的溫度是43℃、37℃、室溫和4℃，其中zui常用的是37℃，也是大多數(shù)抗原抗體反應的適合溫度。為了保證各板的溫度能迅速平衡，可將反應板放在水浴箱中，漂浮在水面上，但反應板不應疊放。為避免標本或稀釋液蒸發(fā)而吸附于孔壁，反應板應加蓋或貼封紙。注意溫育的溫度和時間，應按規(guī)定力求準確無誤。因為孵育時間過長，可以出現(xiàn)非特異性結(jié)合緊附于反應孔周圍，難以清洗*，導致花板。

　　5洗滌

　　洗滌是ELISA不同于均相免疫學檢測技術(shù)的一大特征，洗滌在整個ELISA反應過程雖不是一個反應步驟卻非常關(guān)鍵。操作者應嚴格按照要求洗滌，因為ELISA試驗就是依靠洗滌來達到分離游離的酶標記物和結(jié)合的酶標記物的目的。通過洗滌，可以清除殘留在板孔中沒有與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。采用自動洗板機洗板，洗板機設置時間、間隔、次數(shù)要保持一致，不能過多或過少。洗板次數(shù)較少，造成殘留，引起假陽性結(jié)果。洗板次數(shù)過多，可造成抗原抗體結(jié)合物洗脫，造成假陰性結(jié)果[3]。要保證洗液注滿各孔，防止在反應孔中形成氣泡而造成洗滌不充分。洗板結(jié)束后，在干凈無塵的吸水紙上輕輕拍干。如洗液量不足可致洗板不*，洗板針堵塞，抽吸不*，洗板不暢，導致洗板效果差。

　　6顯色

　　顯色是ELISA試驗中zui后一步溫育反應，此時酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。適當提高溫度，有助于加速顯色。在一定時間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。在定量檢測中，加入底物后的反應溫度和時間應按規(guī)定力求準確。ELISA顯色結(jié)果通過酶標儀進行，可減少實驗誤差，提高臨界值樣本的分析準確度。盡量避免肉眼直接判斷結(jié)果，因為不同個體的視覺存在差異。應注意，加顯色劑時，要保持顯色劑不外流。加終止液時應避免產(chǎn)生較多氣泡，否則可能使假陽性結(jié)果的出現(xiàn)概率增加。

　　7比色

　　比色的方法有目視法和酶標比色法2種。目視法簡單明了，但對同一標本，操作者的不同有時會出現(xiàn)不同的結(jié)果，具有一定的主觀性。比色的結(jié)果通常用光密度表達，現(xiàn)按規(guī)定用吸光度表達。酶標儀不應安置在陽光或強光照射下，操作時的適宜室溫在15℃~30℃之間，使用前要先預熱儀器15~30min，使測得結(jié)果更為準確。比色前，應先用潔凈的吸水紙擦拭干凈板底附著的液體，然后將板正確放在酶標比色儀的比色架上。綜上所述，的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測結(jié)果準確可靠的必要條件。在實際應用過程中，操作者必須熟練掌握基本操作技能，對每個環(huán)節(jié)進行嚴格仔細的核查，盡量避免假陽性和假陰性反應的出現(xiàn)，保證檢測結(jié)果真實可靠，為診斷和疾病防治提供可靠的理論依據(jù)。

 1.2 試劑的準備

在實驗室，對試劑的準備一般 不太注意，通常的做法是在實驗時將試劑從冰箱中拿出來即用，而忽 略了這種做法有可能影響后面時間不夠的問題，其直接的后果是對一 些弱陽性標本的檢測出現(xiàn)假陰性。因此，在ELISA 測定中試劑的準 備zui為關(guān)鍵的是，將試劑盒先從冰箱中拿出來，在室溫下放置20~ 30 min 后，再進行測定，使試劑盒在使用前與室溫平衡，這樣做的 目的能使反應微孔內(nèi)的溫度較快地達到所需的溫度，以滿足后面的測 定需求。 樣本的因素

2.1 內(nèi)源性干擾因素 包括類風濕因子、 補體、高濃度的非特異免疫球蛋白、異嗜性抗體、某些自身抗體等。 2.1.1 類風濕因子在類風濕患者及正常人血清中，常含有較高或不同 濃度的類風濕因子，其一般為IgM 型，亦有IgG 和IgA 型，具有與 變性IgG 產(chǎn)生非特異結(jié)合的特點，因為在ELISA 上包被的特異抗體IgG以及隨后加入的酶標的特異抗體IgG 結(jié)合， 從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。避免其發(fā)生的方法有:用F2 替代完整的IgG。 標本用聯(lián)有熱變性IgG 的固相吸附劑處理。檢測抗原時，可用 2-巰基乙醇加入到標本稀釋液中使RF 降解。

2.1.2 補體在固相酶 免疫測定中，來自哺乳動物的固相抗體和酶標二抗均有激活人補體系 統(tǒng)的功能。一方面，固相抗體和酶標二抗可因其吸附及結(jié)合過程中抗 體分子發(fā)生變構(gòu)，使Fc 段的補體C1q 結(jié)合點暴露出來，使C1q 成為 一個中介物將二者交聯(lián)起來出現(xiàn)假陽性結(jié)果。另一方面，固相抗體也 會因為活化補體的結(jié)合，封閉抗體和抗原的表位結(jié)合能力而引起假陰 性。解決的辦法是:用EDTA 稀釋標本。56 30 min 加熱血清 使C1q 2.2外源性干擾因素 包括標本溶血、標本被細菌污 染、標本保存時間過長和標本凝固不全等。 2.2.1 標本的溶血血紅 蛋白中含鐵血紅素有類過氧化物酶的活性，因此，在以辣根過氧化物 酶為標志的ELISA 測定中，如血清樣本中血紅蛋白濃度較高，則很 容易在溫育過程中吸附于固相，從而與后面加入的HRP 底物反應顯 色。所以在采血時應注意手法，采集的血液勿用力振蕩，嚴防標本溶血。