五分鐘速成!二抗選擇zui全攻略Get

當(dāng)你想花zui多5分鐘來(lái)選擇二抗時(shí)，過(guò)程總是另你措手不及。 結(jié)合物、F (ab’)2片段、親和純化、輕鏈特異性。。?？蛇x擇性似乎太多了。不要緊，小編和你一起梳理下二抗的各種形式和類型。

通常二抗都會(huì)結(jié)合到某個(gè)分子上，以方便檢測(cè)到二抗（因?yàn)橐豢勾蠖鄶?shù)都直接和某個(gè)抗原片段結(jié)合，直接檢測(cè)很困難）。

酶標(biāo)二抗

二抗常與一些酶如過(guò)氧化物酶（通常為辣根過(guò)氧化物酶，HRP）或堿性磷酸酶（AP）結(jié)合。將二抗與合適的底物孵育可以產(chǎn)生顏色或光以檢測(cè)預(yù)期的蛋白。比色測(cè)定通常用于免疫組織化學(xué)（IHC/ICC）或ELISA，而發(fā)光底物則用于Western印跡。

生物素標(biāo)記二抗

生物素（Biotin）標(biāo)記的二抗通常用于擴(kuò)增信號(hào)并增加檢測(cè)的靈敏性，鏈霉親和素（Streptavidin, SA）與Biotin特異性結(jié)合，形成SA-Biotin系統(tǒng)可偶聯(lián)抗原、抗體、報(bào)告酶、寡核苷酸分子及熒光物質(zhì)，廣泛用于生物反應(yīng)檢測(cè)系統(tǒng)。

多聚復(fù)合物標(biāo)記二抗

一些公司研發(fā)出多聚復(fù)合物標(biāo)記的二抗和相關(guān)的檢測(cè)試劑盒。

將多聚復(fù)合物標(biāo)記在二抗上，形成類似于章魚(yú)的超大抗體-酶復(fù)合物，其巨大的復(fù)合物所含分子量遠(yuǎn)高于常規(guī)復(fù)合物標(biāo)記的抗體，更加靈敏和高特異性。強(qiáng)大的組織細(xì)胞滲透力及信號(hào)放大能力，特別適合應(yīng)用于IHC及其它需要放大信號(hào)的ELISA，蛋白質(zhì)印跡等。

熒光標(biāo)記的二抗與熒光染料結(jié)合，通常用于流式檢測(cè)（FC），細(xì)胞或組織中蛋白質(zhì)的免疫熒光檢測(cè)（IF）。zui近，也應(yīng)用于Western印跡分析的CCD檢測(cè)。

幾種不同顏色的熒光染料可用于允許同時(shí)檢測(cè)多種蛋白（雙標(biāo)或三標(biāo)）。常用的熒光染料除了經(jīng)典的AMCA、FITC、Cy3等，目前市面上*的的IFKine、Dylight、Alexa Fluor已然已經(jīng)成為科研工作者的新寵。

動(dòng)物來(lái)源

二抗必須能識(shí)別一抗。如果一抗是小鼠單克隆抗體，分離類型是小鼠IgG1，那么二抗必須選擇抗小鼠IgG的抗體；同樣，如果一抗來(lái)源于山羊，二抗必須選擇抗山羊的抗體。

類和亞類

二抗還必須對(duì)應(yīng)一抗的類和亞類。尤其是一抗是均質(zhì)的單克隆抗體時(shí)，這點(diǎn) 特別重要。例如，一些一抗分離類型是小鼠IgM，而有一些是IgG。

購(gòu)買二抗時(shí)注意分別選擇抗小鼠IgM和小鼠IgG的抗體。 小鼠IgG抗體還可以分為各種亞類，如IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG2c，IgG3。雖然可購(gòu)買能識(shí)別所有亞類的一般的抗小鼠IgG二抗，但盡可能購(gòu)買抗某一特定亞類的抗體以增加特異性。

大多數(shù)物種的分離類型都是IgG，物種特異性抗IgG抗體能很好地工作。但注意鳥(niǎo)類或禽類的免疫球蛋白為IgY。

抗重鏈或輕鏈二抗

Ig分子的基本結(jié)構(gòu)是由四肽鏈組成的。即：由二條相同的分子量較小的肽鏈(輕鏈，Light chain)和二條相同的分子量較大的肽鏈(重鏈，Heavy chain)組成。

抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域?yàn)镕ab片段。 Fab片段是高度可變的，說(shuō)明抗體抗原的特異性。每條重鏈和輕鏈還含有稱為保守區(qū)的非可變區(qū)或稱Fc片段。 可以購(gòu)買僅識(shí)別特定部分（重鏈或輕鏈）的二抗。

zui常見(jiàn)的二抗類型是同時(shí)可以抗重鏈和輕鏈的抗體，表示方式為anti-Ig G(H+L)。在免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)和免疫共沉淀(co-Immunoprecipitation, co-IP) 實(shí)驗(yàn)中，常常因?yàn)橛邢薜囊豢?，IP和WB的操作過(guò)程中而不得不用到相同的一抗或同種屬來(lái)源的一抗，這種情況下，如果使用常規(guī)的Anti-IgG（H+L）二抗，WB實(shí)驗(yàn)中IP抗體變性后產(chǎn)生的重鏈（55kDa）和輕鏈（25kDa）都能夠識(shí)別.

而此非特異的信號(hào)往往會(huì)部分甚至*掩蓋目的蛋白的信號(hào)，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如果目標(biāo)蛋白分子量小于30Kda，為了避免抗體輕鏈的干擾，您使用重鏈特異性的二抗。

F(ab’)2或Fab形式二抗

在IHC或ICC實(shí)驗(yàn)中，有些細(xì)胞或組織表面Fc受體較多，為避免二抗與Fc受體非特異性結(jié)合，導(dǎo)致高背景，F(xiàn)(ab’)2形式的二抗是更好的選擇。

另外，F(xiàn)(ab’)2形式的二抗，其分子本身較小，更容易滲透到細(xì)胞、組織內(nèi)，靈敏度更高。單價(jià)的Fab二抗只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，可以用來(lái)封閉免疫雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)中同一物種來(lái)源的兩種一抗。能有效的解決IF雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)中，兩個(gè)一抗來(lái)自同一種屬時(shí)的困境。

親和純化二抗

抗體純化的目的是增加抗體的特異性，需要親和純化的抗體通過(guò)含有目標(biāo)抗原的柱子。因此，它們通常能zui大限度的減少非特異性結(jié)合。另外，親和純化后的抗體是高親和力抗體，可用于檢測(cè)低豐度的蛋白。

血清吸附的二抗

一些二抗通常會(huì)經(jīng)過(guò)人或其它動(dòng)物IgG吸附。這類抗體能減少非特異性結(jié)合，特別適合應(yīng)用于一些免疫檢測(cè)如IHC。如在IHC實(shí)驗(yàn)中，樣本來(lái)源于人，則可選擇經(jīng)人血清吸附的二抗，以避免二抗和樣本發(fā)生交叉反應(yīng)，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

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