產(chǎn)品描述

《Quick Cell探針法支原體檢測試劑盒》（Quick Cell qPCR Mycoplasma Detection Kit with Probe）采用支原體特異性引物和支原體特異性熒光探針（報(bào)告基因?yàn)镕AM），用于對(duì)樣品的支原體基因組DNA進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增檢測。試劑盒內(nèi)同時(shí)含有內(nèi)參對(duì)照質(zhì)粒mycoIC2和相應(yīng)的引物和熒光探針（報(bào)告基因?yàn)閂IC），用于監(jiān)控支原體DNA提取和qPCR擴(kuò)增的效率。本試劑盒可用于檢測一切可能含支原體的樣品，比如：體外細(xì)胞培養(yǎng)的上清、血清、各種體液（如唾液、尿液、鼻腔分泌物）、別的液體樣品。
經(jīng)多次測試，本試劑盒有記錄可以識(shí)別在體外細(xì)胞培養(yǎng)中曾經(jīng)報(bào)道出現(xiàn)的20種支原體。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，這些支原體基本上占污染細(xì)胞的支原體種類的100%。具體如下：（1）M. hyorhinis、（2）M. fermentans、（3）M. arginini、（4）M. hominis、（5）M. orale、（6）M. salivarium、（7）M.pirum、（8）A. laidlawii、（9）M. agalactiae、（10）M. bovis、(11) M. bovoculi、（12）A. axanthum、（13）M. buccale、 (14) M. pneumoniae、（15）M. arthritidis、（16）M. pulmonis、（17）M. gallisepticum、（18）M. gallinarum、（19）M. canis、（20）Ureaplasma urealyticum（注：M.為Mycoplasma的縮寫；A.為Acholeplasma的縮寫）。

訂購信息

產(chǎn)品組分

【注】：①本試劑盒由于含有內(nèi)參質(zhì)粒mycoIC2（用于監(jiān)控支原體DNA提取和qPCR擴(kuò)增的有效性），客戶可以選擇進(jìn)行樣品支原體DNA的提?。▋?nèi)參質(zhì)粒mycoIC2在支原體DNA提取過程中加入），也可以選擇不進(jìn)行樣品支原體DNA的提?。▋?nèi)參質(zhì)粒mycoIC2直接加入樣品中）。
②本試劑盒的配套儀器可以是任何具有FAM和VIC檢測通道的熒光定量PCR儀。
運(yùn)輸與保存
藍(lán)冰運(yùn)輸。-20℃避光保存，有效期60個(gè)月。
使用方法
1.待測樣品的準(zhǔn)備
為了準(zhǔn)確判斷細(xì)胞是否有支原體的污染，待測的細(xì)胞培養(yǎng)液樣品需要取自換液后培養(yǎng)2-3 d 且匯合度在90%左右的細(xì)胞培養(yǎng)液上清（貼壁細(xì)胞）。懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞也需要在換液傳代后，讓細(xì)胞生長2-3 d 再取培養(yǎng)液進(jìn)行檢測。可以按照以下兩種方法之一進(jìn)行樣品的前處理：
方法一：對(duì)樣品進(jìn)行支原體DNA的提取
（1）很多樣品（比如：培養(yǎng)很多天的細(xì)胞上清、血清、血漿等）由于含有抑制PCR擴(kuò)增的成分，如果樣品不進(jìn)行前處理而直接檢測，有可能導(dǎo)致qPCR擴(kuò)增失?。╭PCR結(jié)果：支原體通道和內(nèi)參對(duì)照通道均無擴(kuò)增曲線）。該類樣品建議客戶進(jìn)行樣品DNA提取（或者離心清洗，見后文方法二）后，再進(jìn)行檢測。提取DNA的過程有兩個(gè)作用：①可以*去除所有可能抑制PCR擴(kuò)增的成分，保證后續(xù)定量PCR擴(kuò)增的正常進(jìn)行；②具有濃縮支原體DNA的作用，可以提高相對(duì)檢測靈敏度10-100倍。
方法二：樣品不經(jīng)DNA提取（推薦本方法，不僅可以濃縮支原體從而提高相對(duì)檢測靈敏度，還可以去除絕大部分可能的抑制物，PCR擴(kuò)增被抑制的可能性極低）
（1）根據(jù)濃縮倍數(shù)，可以取100 - 1500 μL上述待測樣品到1.5 mL離心管內(nèi)，在普通臺(tái)式離心機(jī)上1000 rpm (大約150 g)低速離心5 min，將離心后的上清轉(zhuǎn)移到另一個(gè)離心管內(nèi)，丟棄細(xì)胞沉淀。
（2）將上清繼續(xù)13000 rpm（約16000 g）高速離心5 min，小心吸走全部上清（勿碰到沉淀?。?0μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8（樣品可長期保存）重懸沉淀（沉淀中含有支原體），吹吸均勻（如果最初使用了1500 μL的樣品，則支原體濃度大約提高了30倍）。
（3）往50 μL重懸后的樣品中加入4 μL內(nèi)參質(zhì)粒mycoIC2（內(nèi)參質(zhì)粒融化后，請(qǐng)混勻后再吸取）。
（4）進(jìn)行熱處理后再檢測,具體如下：95 ℃加熱處理5 min（可以轉(zhuǎn)移到PCR管內(nèi)，在PCR儀上進(jìn)行加熱處理），簡單離心（1000 g，5 s）后，取上清進(jìn)行檢測。
【注】：①這里的細(xì)胞培養(yǎng)上清不是指細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后的離心上清，而是指至少培養(yǎng)2 d 后的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)液上清（不需要胰酶消化，也不能取經(jīng)胰酶消化后的離心上清進(jìn)行檢測）或懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液。
②本步驟的低速離心,需要嚴(yán)格控制在150-200 g，該離心力下哺乳動(dòng)物細(xì)胞將被沉淀下來而支原體不會(huì)；否則，容易導(dǎo)致假陰性。
③收集的待測細(xì)胞培養(yǎng)液樣品如果不立即檢測，請(qǐng)放于-20℃或-80℃冰箱保存；為了節(jié)約檢測成本，可以將不同時(shí)間收集的樣品放于-20℃或-80℃冰箱保存，而后一起檢測。

2.熒光定量PCR體系的配制（本步驟所有操作建議使用濾芯吸頭，以避免試劑被污染）
　　將探針法溶液1P、陽性支原體DNA、去離子水從-20 ℃冰箱中取出，放室溫融化（也可以用手握住幫助融化）。探針法溶液1P和探針法溶液2T開蓋之前，請(qǐng)高速離心一下（5000 rpm，離心1 min）。探針法溶液2T不能在室溫長久放置，建議在-20 ℃冰箱直接吸取。
　　如果樣品總數(shù)為N（N=待測樣品數(shù)+1個(gè)陽性對(duì)照+1個(gè)陰性對(duì)照），qPCR反應(yīng)體系分為樣品經(jīng)DNA提取和不經(jīng)DNA提取兩個(gè)不同反應(yīng)體系，具體如下：
2.1 樣品進(jìn)行DNA提取后的反應(yīng)體系（在DNA提取過程中，必須按說明書加入內(nèi)參質(zhì)粒mycoIC2）：
（1）反應(yīng)體系：
表1. 樣品經(jīng)DNA提取后的反應(yīng)體系

【注】：總體積中多配制10%，為了防止移液誤差；裝有陽性支原體DNA的螺口管請(qǐng)不要高速離心，開蓋之前，只要用手指捏住，用力甩一下即可。吸取之前，請(qǐng)吹吸均勻后再吸取。如果不小心高速離心了，務(wù)必吹吸均勻后再吸取，否則陽性對(duì)照結(jié)果可能異常。
【例】：如果待測樣品為8個(gè)（加上1個(gè)陰性和1個(gè)陽性對(duì)照），則樣品總數(shù)為10個(gè)。探針法溶液1P的總體積為11×10×1.1=121 μL，探針法溶液2T的總體積為1×10×1.1=11 μL。
（2）將上述2種溶液混合，吹打均勻后，按每管12  μL分裝到熒光定量PCR八聯(lián)管中。
（3）待測樣品管加入18 μL提取好的待測樣品DNA（樣品DNA加入量不能減少，否則內(nèi)參質(zhì)粒擴(kuò)增可能失敗）；陰性對(duì)照管加入2 μL內(nèi)參質(zhì)粒mycoIC2（吹吸均勻后加入）和16 μL去離子水（為防止去離子水被污染，此處建議使用20 μL移液槍配合200 μL吸頭進(jìn)行吸取操作）；陽性對(duì)照管加入2 μL陽性支原體DNA 和16 μL去離子水。每管反應(yīng)液的總體積為30 μL。
2.2 樣品不經(jīng)DNA提取的反應(yīng)體系：


（1）反應(yīng)體系：
表2. 樣品不經(jīng)DNA提取的反應(yīng)體系

【注】：總體積中多配制6%，為了防止移液誤差，以保證每個(gè)反應(yīng)管中的反應(yīng)液足量；裝有陽性支原體DNA的螺口管請(qǐng)不要高速離心，開蓋之前，只要用手指捏住，用力甩一下即可。吸取之前，請(qǐng)吹吸均勻后再吸取。如果不小心高速離心了，務(wù)必吹吸均勻后再吸取，否則陽性對(duì)照結(jié)果可能異常。
【例】：如果待測樣品為8個(gè)（加上1個(gè)陰性和1個(gè)陽性對(duì)照），則樣品總數(shù)為10個(gè)。去離子水的總體積為16×10×1.06=169.6 μL 探針法溶液1P的總體積為11×10×1.06=116.6 μL，探針法溶液2T的總體積為1×10×1.06=10.6 μL。
（2）將上述3種溶液混合，吹打均勻后，按每管28 μL分裝到熒光定量PCR八聯(lián)管中。
（3） 待測樣品管加入2 μL未提取的待測樣品DNA，陰性對(duì)照管加入2 μL內(nèi)參質(zhì)粒mycoIC2（吹吸均勻后加入），陽性對(duì)照管加入2 μL陽性支原體DNA。每管反應(yīng)液的總體積為30 μL。
2.3 蓋上熒光定量PCR八聯(lián)管蓋子，去除反應(yīng)管中的大氣泡，3000-6000 rpm離心30 sec。

3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增
　　將PCR八聯(lián)管放入熒光定量PCR儀內(nèi)，設(shè)置如下實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增程序：
表3. 熒光定量PCR擴(kuò)增程序

【注】：支原體檢測熒光通道選擇FAM（Reporter: FAM，Quencher: None）；內(nèi)參對(duì)照檢測熒光通道選擇VIC（Reporter: VIC, Quencher: None）；反應(yīng)體積（Sample Volume）為30 μL；參考熒光（Passive Reference，只有ABI儀器需要設(shè)置）選擇None。

4.結(jié)果分析
4.1 ABI StepOne Plus 熒光定量PCR儀基線和閾值設(shè)定方法（其他熒光定量PCR儀的設(shè)置大同小異，請(qǐng)參考各自儀器說明書進(jìn)行設(shè)置）：
（1）基線（Baseline）的設(shè)定：可以將Auto baseline前面的√ 去掉，然后手動(dòng)設(shè)置基線的起點(diǎn)為2（將剛開始熒光值不穩(wěn)定的幾個(gè)循環(huán)排除在基線之外。如果起點(diǎn)2不合適，可以適當(dāng)增減），終點(diǎn)為10左右。
（2）閾值（Threshold）線的設(shè)定：不同通道的閾值應(yīng)該分別設(shè)定。設(shè)定某個(gè)通道閾值線時(shí)，首先選中含陰性對(duì)照的若干個(gè)樣品，去掉儀器勾選的自動(dòng)Threshold線，將其選項(xiàng)“√ Auto"改為“  Auto"，然后手動(dòng)調(diào)整閾值線，以閾值線剛好超過正常陰性對(duì)照FAM通道擴(kuò)增曲線（無規(guī)則噪音線）的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。
4.2 實(shí)驗(yàn)有效性判斷：
　　陽性對(duì)照管：其FAM通道有典型的S型擴(kuò)增曲線（即指數(shù)擴(kuò)增），其VIC通道的擴(kuò)增線呈直線或者S型曲線。
　　陰性對(duì)照管：其FAM通道的擴(kuò)增線呈直線，其VIC通道應(yīng)該有典型的S型擴(kuò)增曲線。
　　如果陽性對(duì)照管、陰性對(duì)照管同時(shí)滿足上述條件，則說明本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效，否則實(shí)驗(yàn)結(jié)果無效。
　　典型的陰性直線型擴(kuò)增線和陽性S型擴(kuò)增曲線如圖1所示：

圖1. 典型的陰性直線型擴(kuò)增線（左）和陽性S型擴(kuò)增曲線（右）

4.3 待測樣品結(jié)果判斷：
　　待測樣品有可能出現(xiàn)以下4種組合：
表4. 待測樣品管FAM通道和VIC通道可能組合

　　待測樣品管只要FAM通道有S型擴(kuò)增曲線（組合1和組合2）就說明有支原體污染。因?yàn)橥饧拥膬?nèi)參質(zhì)粒mycoIC2分子數(shù)極少，如果支原體含量很大時(shí)，內(nèi)參質(zhì)粒的擴(kuò)增會(huì)被*抑制，導(dǎo)致內(nèi)參VIC通道無信號(hào)（組合2）。
　　如果待測樣品管FAM通道呈直線，而VIC通道有S型曲線（樣品的DNA提取過程和PCR擴(kuò)增過程均正常。由于提取過程中，外加的內(nèi)參質(zhì)粒mycoIC2分子數(shù)極少，作為內(nèi)參對(duì)照的VIC通道的Ct值會(huì)比較大），說明樣品無支原體。
如果陽性對(duì)照管和陰性對(duì)照管結(jié)果正常，而待測樣品管FAM通道和VIC通道均呈直線，說明PCR被抑制。如果樣品是經(jīng)過提取的，最可能原因是：DNA洗脫前，吸附膜中的乙醇沒有揮發(fā)*（解決方法：洗脫前，將吸附柱放50-65℃烘箱至少15 min）。如果樣品是沒有經(jīng)過提取的，則樣品本身含有抑制PCR的成分（解決方法：將樣品進(jìn)行DNA提取或者離心清洗）。此外，二者相同的可能原因有（此種情況發(fā)生概率很低，一般不需要考慮）：內(nèi)參質(zhì)粒mycoIC2在運(yùn)輸和儲(chǔ)存中有部分降解，導(dǎo)致回收或者加入的內(nèi)參質(zhì)粒mycoIC2分子偏少，導(dǎo)致內(nèi)參VIC通道擴(kuò)增失?。ń鉀Q方法：將內(nèi)參質(zhì)粒mycoIC2的加入量增加到原來的2-4倍）。
【注】：陽性結(jié)果需要結(jié)合擴(kuò)增曲線（主要）和Ct值（次要）進(jìn)行判斷，不能只看Ct值（因熒光值的波動(dòng)，個(gè)別陰性樣品雖然擴(kuò)增曲線基本呈直線，但可能會(huì)出現(xiàn)Ct值，此類樣品不能判斷為陽性。反之亦然：有些樣品有S型曲線，但是因?yàn)闊晒庵挡▌?dòng)，導(dǎo)致沒有Ct值，此類樣品不能判斷為陰性）。
注意事項(xiàng)

1. 本產(chǎn)品主要用于細(xì)胞上清支原體污染檢測，僅限于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域

2. 防DNA污染注意事項(xiàng)：

（1）強(qiáng)烈建議所有操作（特別是qPCR體系配制步驟和吸取試劑盒中試劑的時(shí)候）使用濾芯吸頭進(jìn)行操作，以免試劑被污染。
（2）必須確保使用的移液槍本身沒有殘留的支原體。
（3）樣品前處理的各類吸頭、離心管，以及吸取陽性對(duì)照DNA、待測樣品DNA的吸頭，務(wù)必小心處理，請(qǐng)將其裝入含有半瓶水的帶蓋的、可密封的瓶子內(nèi)，全部樣品吸取完后，蓋上瓶蓋，以防止陽性DNA的揮發(fā)，造成環(huán)境的污染，進(jìn)而造成假陽性。整個(gè)操作過程，最好不要說話，因?yàn)槿说目谇缓屯僖憾际菐егw的。
（4）反應(yīng)后，請(qǐng)勿打開反應(yīng)管的蓋子，否則有可能造成檢測環(huán)境的污染。結(jié)果判斷完后，將其用自封袋密閉后，進(jìn)行適當(dāng)處理。

3. 實(shí)驗(yàn)室必須嚴(yán)格分房間操作（本試劑盒建議在有窗戶、通風(fēng)良好的普通房間內(nèi)操作，請(qǐng)勿在密閉的房間操作。請(qǐng)勿在細(xì)胞培養(yǎng)間進(jìn)行該步驟的操作，因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)間支原體污染概率很高）：

　　試劑配制房間1：專門進(jìn)行定量PCR體系的配制（建議該房間全部使用進(jìn)口濾芯吸頭。）
DNA提取房間2：專門進(jìn)行支原體DNA的提取；
DNA加樣房間3：專門進(jìn)行定量PCR體系配制后，添加待測樣品、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照等操作；
PCR擴(kuò)增房間4：進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增檢測。
【注】：如果房間緊張，可以考慮將房間2、房間3合并在一個(gè)房間，而房間1和房間4必須獨(dú)立。各房間物品（包括移液槍）均為專用，不得交叉使用。
如果出現(xiàn)qPCR的擴(kuò)增被細(xì)胞的代謝產(chǎn)物抑制時(shí)（qPCR結(jié)果：支原體通道和內(nèi)參對(duì)照通道均無擴(kuò)增曲線），可以采取以下幾種措施：
（1）將取樣的時(shí)間提前到換液后2 d或3 d，此時(shí)細(xì)胞上清的PCR擴(kuò)增抑制物相對(duì)比較少，一般不會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的抑制。據(jù)我們測試，換液后5 d，PCR擴(kuò)增抑制物就已經(jīng)大量積累。
（2）用PBS對(duì)待測樣品進(jìn)行離心清洗，去除樣品中的抑制物。具體方法如下：取1 mL細(xì)胞上清，先13000 rpm離心5 min，吸走950 μL上清；加PBS 950 μL，再次離心，吸走950 μL上清；再加PBS 950 μL，第三次離心，吸走全部上清，用50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8 重懸沉淀，95 ℃加熱處理5 min，簡單離心（1000 g，5 s）后，取上清進(jìn)行檢測。但是該方法有如下缺點(diǎn)：第一，如果樣品支原體含量較少，離心清洗可能導(dǎo)致漏檢，因?yàn)殡x心清洗過程中，可能導(dǎo)致支原體部分丟失。第二，個(gè)別樣品，即使經(jīng)過上述清洗也無法*去除抑制劑。
（3）抽提細(xì)胞上清的支原體DNA后再進(jìn)行PCR鑒定。
（4）使用李記生物的《Quick Cell支原體快速檢測試劑盒(細(xì)胞培養(yǎng)專用)》（貨號(hào)：AC16L061）或者《Quick Cell 發(fā)光法支原體檢測試劑盒》（貨號(hào)：AC16L062）進(jìn)行檢測，經(jīng)測試，未發(fā)現(xiàn)這兩種試劑盒會(huì)被細(xì)胞的代謝產(chǎn)物所抑制。為了預(yù)防PCR的擴(kuò)增被細(xì)胞的代謝產(chǎn)物抑制的問題，也可以考慮將所有待測樣品全部進(jìn)行離心清洗或者DNA提取后，再使用本試劑盒進(jìn)行檢測。

4. 支原體檢測樣品可以分成兩類：第一類，用含血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞上清液，由于該條件非常適合支原體生長，培養(yǎng)數(shù)天后，支原體密度一般較高，可達(dá)107-9/mL，可以直接檢測。第二類，低溫保存的血漿、血清、臍帶血、胰酶、抗生素、未使用的培養(yǎng)液等樣品，由于這些樣品即使有支原體污染，支原體含量一般很少，直接使用快速支原體檢測試劑盒進(jìn)行檢測，往往檢測不出來。這些樣品建議：（1）對(duì)樣品的支原體進(jìn)行離心濃縮將支原體DNA濃縮提取，該兩種方法大約可以將檢測靈敏度繼續(xù)提高10-100倍。該方法速度快，當(dāng)天出結(jié)果，但是可靠性不如后面的培養(yǎng)法。（2）使用支原體液體培養(yǎng)基（必須同時(shí)接種不含精氨酸和含精氨酸的兩種支原體液體培養(yǎng)基）培養(yǎng)3-7 d后，再進(jìn)行檢測。具體方法請(qǐng)參考李記生物《Quick Cell 發(fā)光法支原體檢測試劑盒》（貨號(hào)：AC16L062）說明書中最后的注意事項(xiàng)部分。該方法速度較慢，需要3-7 d，但是可靠性高。

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