ELISA樣本制備及注意事項(xiàng)

ELISA樣本制備及注意事項(xiàng)

一、血清的采集、處理和保存

1、真空采血針采集新鮮血液，加入無菌試管中；

2、采血后室溫靜置1小時(shí)；

3、將采集血液用離心機(jī)4℃，2500rpm離心10min；

4、取上清。分裝凍存?zhèn)溆茫?/p>

2-8℃下，可放置保存24-48小時(shí)；

-20℃下，可放置保存1個(gè)月；

-80℃下，可放置保存6個(gè)月；

5、根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)需要，取適量上清夜進(jìn)行各種ELISA測定。

大部分ELISA檢測均以血清為標(biāo)本。血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集，應(yīng)注意避免溶血，紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標(biāo)記的ELISA測定中，溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異顯色。此外還應(yīng)避免細(xì)菌污染，因?yàn)榫w中可能含有含有內(nèi)源性HRP，也會(huì)產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。血清標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測。如在冰箱中保存過久，其中的可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深。

二、ELISA 實(shí)驗(yàn)中血漿的采集、處理和保存

1、真空采血針采集2ml 新鮮血液，加入無菌試管中；

2、按 1:9加入抗凝劑（EDTA、草酸鈉、肝素、枸櫞酸鈉），30分鐘內(nèi)于冰上分離血漿以減少血小板的污染；（也可以直接用抗凝管采集）；

3、將采集血液用離心機(jī)4℃，2500rpm離心5min；

4、取上清。分裝凍存?zhèn)溆茫?/p>

2-8℃下，可放置保存24-48小時(shí)；

-20℃下，可放置保存1個(gè)月；

-80℃下，可放置保存6個(gè)月；

5、根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)需要，取適量上清夜進(jìn)行各種ELISA測定。請(qǐng)注意指標(biāo)說明書上對(duì)于抗凝血?jiǎng)┦欠裼刑厥庖?，建議使用EDTA。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等于血清。制備血漿標(biāo)本需借助于抗凝劑EDTA，抗凝不*的標(biāo)本因纖維蛋白原干擾而造成假陽性。

三、ELISA 實(shí)驗(yàn)中尿液的采集、處理和保存

1、采集尿液樣本500ul，加入無菌試管中；

2、將采集血液用離心機(jī)4℃，2500rpm離心10min；

3、取上清。分裝凍存?zhèn)溆茫?/p>

2-8℃下，可放置保存24-48小時(shí)；

-20℃下，可放置保存1個(gè)月；

-80℃下，可放置保存6個(gè)月；

4、根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)需要，取適量上清夜進(jìn)行各種ELISA測定。

四、ELISA 實(shí)驗(yàn)中腦脊液的采集、處理和保存

1、采集腦脊液樣本，加入無菌試管中；

2、將采集的腦脊液用離心機(jī)4℃，2500rpm 離心10min；

3、取上清。分裝凍存?zhèn)溆茫?/p>

2-8℃下，可放置保存24-48小時(shí)；

-20℃下，可放置保存1個(gè)月；

-80℃下，可放置保存6個(gè)月；

4、根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)需要，取適量上清夜進(jìn)行各種ELISA 測定。

五、ELISA 實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞上清液的采集、處理和保存

1、采集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，加入無菌試管中；

2、將采集的細(xì)胞上清液用離心機(jī)4℃，2500rpm離心10min；

3、取上清。分裝凍存?zhèn)溆茫?/p>

2-8℃下，可放置保存24-48小時(shí)；

-20℃下，可放置保存1個(gè)月；

-70℃下，可放置保存6個(gè)月；

4、根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)需要，取適量上清夜進(jìn)行各種ELISA 測定。

六、ELISA 實(shí)驗(yàn)中肺泡灌洗液的采集、處理和保存

1、10%水合氯醛溶液，腹腔麻醉；

2、打開腹腔，另取10ml注射器行下腔靜脈采血，盡可能將血放盡；

3、在冰面上對(duì)左肺進(jìn)行肺灌洗。取37℃生理鹽水5ml，分三次灌洗：2ml、1.5ml、1.5ml灌，?；厥章试?0%以上；

4、將采集的肺泡灌洗液用離心機(jī)4℃，2500rpm離心10min；

5、取上清。分裝凍存?zhèn)溆茫?/p>

2-8℃下，可放置保存24-48小時(shí)；

-20℃下，可放置保存1個(gè)月；

-70℃下，可放置保存6個(gè)月；

6、根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)需要，取適量上清夜進(jìn)行各種ELISA 測定。

七、ELISA 實(shí)驗(yàn)中關(guān)節(jié)滑液的采集、處理和保存

1、口腔關(guān)節(jié)：患者取坐位，常規(guī)消毒后，作皮下及關(guān)節(jié)后區(qū)局部浸潤麻醉。然后囑患者大張口，采用裝有2ml生理鹽水的注射器（5號(hào)針頭）作關(guān)節(jié)上腔穿刺，髁后進(jìn)針，針尖方向斜向前、內(nèi)、上，抵達(dá)關(guān)節(jié)結(jié)節(jié)后斜面后稍后退，回抽如發(fā)現(xiàn)有淡黃色液體，即表明已進(jìn)入關(guān)節(jié)上腔，注入2ml生理鹽水，反復(fù)注入、回抽五次；

2、膝骨關(guān)節(jié)滑液：無菌穿刺取得關(guān)節(jié)液3ml；

3、將采集的關(guān)節(jié)滑液用離心機(jī)4℃，1500rpm離心15min；

4、取上清。分裝凍存?zhèn)溆茫?/p>

2-8℃下，可放置保存24-48小時(shí)；

-20℃下，可放置保存1個(gè)月；

-70℃下，可放置保存6個(gè)月；

5、根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)需要，取適量上清夜進(jìn)行各種ELISA 測定。

八、ELISA 實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞的采集、處理和保存

1、細(xì)胞板貼壁細(xì)胞直接裂解：細(xì)胞棄培養(yǎng)上清，PBS清洗三遍，加適量裂解液重懸（過量會(huì)降低濃度，很重要），超聲破碎或用槍吹打100下；

2、細(xì)胞團(tuán)塊裂解：細(xì)胞團(tuán)塊加1ml PBS重懸（注意不要過于劇烈造成細(xì)胞破裂），1000rpm離心5分鐘，棄上清，重復(fù)3次，加適量裂解液重懸（過量會(huì)降低濃度，很重要），超聲破碎或用槍吹打100下；

3、懸浮細(xì)胞裂解：轉(zhuǎn)移至EP管，1000rpm離心5分鐘，棄上清，PBS洗三遍，加適量裂解液重懸（過量會(huì)降低濃度，很重要），超聲破碎或用槍吹打100下；

4、冰上裂解30mins，用離心機(jī)4℃，12000rpm離心10mins；

5、取上清。分裝凍存?zhèn)溆茫?/p>

2-8℃下，可放置保存24-48小時(shí)；

-20℃下，可放置保存1個(gè)月；

-70℃下，可放置保存6個(gè)月；

6、根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)需要，取適量上清夜進(jìn)行各種ELISA 測定。

根據(jù)要檢測的指標(biāo)，必要時(shí)需要加入蛋白酶抑制劑。如果處理后馬上檢測，也可以不加這些抑制劑直接裂解，裂解液的量根據(jù)不同細(xì)胞系會(huì)有不同，原則為裂解后總蛋白濃度不低于0.5mg/ml。

九、ELISA 實(shí)驗(yàn)中易碎軟組織（腦、肝、腎）的采集、處理和保存

1、稱取組織塊（50mg-100mg），按質(zhì)量體積比1：9加入裂解液（例：50mg組織濕重加入450ul裂解液）；

2、冰水浴中用眼科剪剪碎組織塊；

3、冰水浴中電動(dòng)勻漿機(jī)或超聲破碎；

4、用離心機(jī)4℃，12000rpm離心15mins；

5、取上清。分裝凍存?zhèn)溆茫?/p>

2-8℃下，可放置保存24-48小時(shí)；

-20℃下，可放置保存1個(gè)月；

-70℃下，可放置保存6個(gè)月；

6、根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)需要，取適量上清夜進(jìn)行各種ELISA 測定。

根據(jù)要檢測的指標(biāo)，必要時(shí)需要加入蛋白酶抑制劑。如果處理后馬上檢測，也可以不加這些抑制劑直接裂解。

十、ELISA 實(shí)驗(yàn)中心肌、肌肉組織的采集、處理和保存

1、稱取組織塊（50mg-100mg），按質(zhì)量體積比1：9加入裂解液（例：50mg組織濕重加入450ul裂解液）；

2、冰水浴中用眼科剪剪碎組織塊；

3、冰水浴中研磨棒研磨或超聲破碎；

4、用離心機(jī)4℃，12000rpm離心15mins；

5、取上清。分裝凍存?zhèn)溆茫?/p>

2-8℃下，可放置保存24-48小時(shí)；

-20℃下，可放置保存1個(gè)月；

-70℃下，可放置保存6個(gè)月；

6、根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)需要，取適量上清夜進(jìn)行各種ELISA 測定。

心肌、肌肉組織無法用勻漿機(jī)勻漿，組織塊會(huì)絞入鉆頭形成團(tuán)塊，無法被勻漿機(jī)刀頭切碎，需用研磨或超聲才能充分破碎。根據(jù)要檢測的指標(biāo)，必要時(shí)需要加入蛋白酶抑制劑。如果處理后馬上檢測，也可以不加這些抑制劑直接裂解。

十一、ELISA 實(shí)驗(yàn)中上皮組織（皮膚、膀胱、腸）及人或大鼠眼角膜的采集、處理和保存

1、稱取組織塊（50mg-100mg），按質(zhì)量體積比1：9加入裂解液（例：50mg組織濕重加入450ul裂解液）；

2、冰水浴中用眼科剪剪碎組織塊；

3、冰水浴中研磨棒研磨或超聲破碎；

4、用離心機(jī)4℃，12000rpm離心15mins；

5、取上清。分裝凍存?zhèn)溆茫?/p>

2-8℃下，可放置保存24-48小時(shí)；

-20℃下，可放置保存1個(gè)月；

-70℃下，可放置保存6個(gè)月；

6、根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)需要，取適量上清夜進(jìn)行各種ELISA 測定。

上皮組織韌性較強(qiáng)，較難剪碎，需要增加組織破碎時(shí)間才能充分破碎。根據(jù)要檢測的指標(biāo)，必要時(shí)需要加入蛋白酶抑制劑。如果處理后馬上檢測，也可以不加這些抑制劑直接裂解。

十二、ELISA 實(shí)驗(yàn)中小顆粒組織（神經(jīng)節(jié)、小鼠眼角膜、鞏膜）的采集、處理和保存

1、加入200ul裂解液；

2、冰水浴中用顯微剪剪碎組織塊；

3、冰水浴中研磨棒研磨或超聲破碎；

4、用離心機(jī)4℃，12000rpm離心15mins；

5、取上清。分裝凍存?zhèn)溆茫?/p>

2-8℃下，可放置保存24-48小時(shí)；

-20℃下，可放置保存1個(gè)月；

-70℃下，可放置保存6個(gè)月；

6、根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)需要，取適量上清夜進(jìn)行各種ELISA 測定。

小顆粒組織量比較小，會(huì)有靶標(biāo)蛋白量低于檢測限度的風(fēng)險(xiǎn)，注意組織勻漿離心后上清總蛋白濃度需大于0.5mg/ml。根據(jù)要檢測的指標(biāo)，必要時(shí)需要加入蛋白酶抑制劑。如果處理后馬上檢測，也可以不加這些抑制劑直接裂解。