細(xì)菌的革蘭氏染色和特殊形態(tài)觀察

實(shí)驗(yàn)原理

染色方法：
革蘭染色法是細(xì)菌學(xué)中zui廣泛使用的一種鑒別染色法。1884 年 由丹麥醫(yī)師 Gram 創(chuàng)立。方法是先將細(xì)菌用結(jié)晶紫染色，加媒染劑（增加染料和 細(xì)胞的親和力）后，用脫色劑（酒精或丙酮）脫色，再用復(fù)染劑染色。如果細(xì)菌 不被脫色而保存原染液顏色者為革蘭陽性菌(G＋)；如被脫色，而染上復(fù)染液的顏 色者為革蘭陰性菌(G-)。此染色法可將所有具有細(xì)胞壁的細(xì)菌分為兩大類：革蘭 陽性菌和革蘭陰性菌。

單染色法：只能觀察微生物的大小、形狀、和細(xì)胞排列狀況，但不能鑒別微生物以及它的特殊構(gòu)造等。

復(fù)染色法：用兩種或兩種以上染色液進(jìn)行染色，有協(xié)助鑒別微生物的作用，故也稱鑒別染色法。常用的有：革蘭氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、鞭毛染色法等。

染色原理： 現(xiàn)在認(rèn)為細(xì)菌對革蘭染色的不同反應(yīng)主要是革蘭陽性菌和陰性菌 的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與化學(xué)組成不同。革蘭陽性菌的細(xì)胞壁較厚，肽聚糖含量多，且交 聯(lián)度大，脂類含量少，經(jīng) 95％乙醇脫色時，肽聚糖層的孔徑變小，通透性降低， 與細(xì)胞結(jié)合的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物不易被脫掉，因此細(xì)胞仍保留初染時的顏色。 而革蘭陰性菌的細(xì)胞壁較薄，含有較多的類脂質(zhì)，而肽聚糖的含量較少，乙醇脫 色時溶解外層類脂質(zhì)，增加了細(xì)胞壁的通透性，使初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易 于滲出，結(jié)果細(xì)胞被脫色，經(jīng)復(fù)染后，又染上復(fù)染的顏色。

實(shí)驗(yàn)試劑

革蘭氏染色液一套 
結(jié)晶紫
碘液
95%乙醇
番紅花紅
孔雀綠

實(shí)驗(yàn)設(shè)備

顯微鏡
蓋玻片
載玻片

實(shí)驗(yàn)材料

菌種：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 革蘭氏染色 
  （1）涂片

  （2）初染：在做好的涂面上滴加草酸銨結(jié)晶紫染液，染1分鐘，傾去染液，流水沖洗至無紫色。

  （3）媒染：先用新配的路哥氏碘液沖去殘水，而后用其覆蓋涂面1分鐘，后水洗。

  （4）脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進(jìn)行脫色約15－20秒，后立即用流水沖洗。

  （5）復(fù)染：滴加番紅染色液，染3－5分鐘，水洗后用吸水紙吸干。 

  （6）鏡檢：觀察染色結(jié)果并繪圖。

2. 染色過程：涂片（大腸桿菌和金黃色葡萄球菌）→干燥→固定→初染（結(jié)晶 染色過程： 紫染色 1min）→媒染（碘 1min）→水洗→95%乙醇脫色（1min）→復(fù)染（番紅花 紅染色 1min）→干燥→鏡檢（油鏡）

3. 油鏡的使用與保養(yǎng)
  （1）在需觀察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢轉(zhuǎn)動油鏡，在轉(zhuǎn) 換油鏡時，從側(cè)面水平注視鏡頭與玻片的距離，使鏡頭浸入油中而 又不以壓破載玻片為宜。 
  （2）用雙眼觀察目鏡，并慢慢轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器至出現(xiàn)模糊物象，然后用細(xì) 調(diào)節(jié)器至物象清晰為止。 
  （3）如果不出現(xiàn)物象或者目標(biāo)不理想要重找。 
  （4）油鏡使用完畢，先用擦鏡紙沾少許乙醇將鏡頭上和標(biāo)本上的香柏油 擦去，然后再用干擦鏡紙擦干凈。

注意事項(xiàng)

1. 菌種應(yīng)選用對數(shù)期的菌種； 
2. 涂片不易過厚，涂片薄而均勻?yàn)楹茫?nbsp;
3. 脫色不足或脫色過度均會造成革蘭染色的假陽性或假陰性，脫色時間 取決于涂片厚度、室溫等；
4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)束請確保油鏡頭擦拭干凈。