細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒的說明書

規(guī)格：50T
保存：-20℃保存，一年有效。C1052-2碘化丙啶染色液(20×)需避光保存。本試劑盒可4℃保存，一個(gè)月內(nèi)有效。
產(chǎn)品說明：
細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit)是一種采用經(jīng)典的碘化丙啶染色(Propidium staining，即PI staining)方法進(jìn)行細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡分析的檢測試劑盒。 碘化丙啶(Propidium，簡稱PI)是一種雙鏈DNA的熒光染料。碘化丙啶和雙鏈DNA結(jié)合后可以產(chǎn)生熒光，并且熒光強(qiáng)度和雙鏈DNA的含量成正比。細(xì)胞內(nèi)的DNA被碘化丙啶染色后，可以用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行DNA含量測定，然后根據(jù)DNA含量的分布情況，可以進(jìn)行細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡分析。
碘化丙啶染色后，假設(shè)G0/G1期細(xì)胞的熒光強(qiáng)度為1，那么含有雙份基因組DNA的G2/M期細(xì)胞的熒光強(qiáng)度的理論值為2，正在進(jìn)行DNA復(fù)制的S期細(xì)胞的熒光強(qiáng)度為1-2之間。凋亡細(xì)胞由于細(xì)胞核發(fā)生濃縮以及發(fā)生DNA片段化(DNA fragmentation)導(dǎo)致部分基因組DNA片斷在染色過程中丟失，因此凋亡細(xì)胞碘化丙啶染色后呈現(xiàn)明顯的弱染，即熒光強(qiáng)度小于1，在流式檢測的熒光圖上出現(xiàn)所謂的sub-G1峰，即凋亡細(xì)胞峰。
細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，由于胞漿和染色質(zhì)濃縮、核碎裂，產(chǎn)生凋亡小體，使細(xì)胞的光散射性質(zhì)發(fā)生變化。在細(xì)胞凋亡的早期，細(xì)胞對(duì)前向角光散射的能力顯著降低，對(duì)側(cè)向光散射的能力增加或沒有變化。在細(xì)胞凋亡的晚期，前向和側(cè)向光散射的信號(hào)均降低。因此可通過流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞光散射的變化觀察細(xì)胞凋亡情況。
本試劑盒通常應(yīng)用于培養(yǎng)的貼壁或懸浮細(xì)胞的細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測。如果用于組織的細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測，則必須把組織消化成單細(xì)胞狀態(tài)，才可以進(jìn)行檢測。本試劑盒足夠檢測50個(gè)樣品，每個(gè)樣品的細(xì)胞數(shù)量可以為10-100萬。
試劑盒組成：
試劑名稱 規(guī)格 
染色緩沖液 25mL 
碘化丙啶染色液(20×) 1.25mL 
RNase A (50×) 0.5 mL 
使用方法：（僅供參考）
1. 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：
a. 對(duì)于貼壁細(xì)胞：小心收集細(xì)胞培養(yǎng)液到一離心管內(nèi)備用。用胰酶消化細(xì)胞，至細(xì)胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時(shí)，加入前面收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打下所有的貼壁細(xì)胞，并輕輕吹散細(xì)胞。再次收集到離心管內(nèi)。1000g左右離心3-5分鐘，沉淀細(xì)胞。對(duì)于特定的細(xì)胞，如果細(xì)胞沉淀不充分，可以適當(dāng)延長離心時(shí)間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50微升左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細(xì)胞。加入約1毫升冰浴預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管內(nèi)。再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清，可以殘留約50微升左右的PBS，以避免吸走細(xì)胞。輕輕彈擊離心管底以適當(dāng)分散細(xì)胞，避免細(xì)胞成團(tuán)。
b. 對(duì)于懸浮細(xì)胞：1000g左右離心3-5分鐘，沉淀細(xì)胞。對(duì)于特定的細(xì)胞，如果細(xì)胞沉淀不充分，可以適當(dāng)延長離心時(shí)間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50微升左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細(xì)胞。加入約1毫升冰浴預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管內(nèi)。再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清，可以殘留約50微升左右的PBS，以避免吸走細(xì)胞。輕輕彈擊離心管底以適當(dāng)分散細(xì)胞，避免細(xì)胞成團(tuán)。
2. 細(xì)胞固定：加入1毫升冰浴預(yù)冷70%乙醇中，輕輕吹打混勻，4℃固定2小時(shí)或更長時(shí)間。固定12-24小時(shí)可能效果更佳。1000g左右離心3-5分鐘，沉淀細(xì)胞。對(duì)于特定的細(xì)胞，如果細(xì)胞沉淀不充分，可以適當(dāng)延長離心時(shí)間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50微升左右的70%乙醇，以避免吸走細(xì)胞。加入約1毫升冰浴預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞。再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清，可以殘留約50微升左右的PBS，以避免吸走細(xì)胞。輕輕彈擊離心管底以適當(dāng)分散細(xì)胞，避免細(xì)胞成團(tuán)。
3. 碘化丙啶染色液的配制：參考下表，根據(jù)待檢測樣品的數(shù)量配制適量的碘化丙啶染色液：
試劑名稱 1個(gè)樣品 6個(gè)樣品 12個(gè)樣品 
染色緩沖液 0.5mL 3mL 6mL 
碘化丙啶染色液(20×) 25μL 150μL 300μL 
RNase A (50×) 10μL 60μL 120μL 
Final volume 0.535 mL 3.21 mL 6.42 mL 
注：配制好的碘化丙啶染色液短時(shí)間內(nèi)可以4℃保存，宜當(dāng)日使用。
4. 染色：每管細(xì)胞樣品中加入0.5毫升碘化丙啶染色液，緩慢并充分重懸細(xì)胞沉淀， 37℃避光溫浴30分鐘。隨后可以4℃或冰浴避光存放。染色完成后宜在24小時(shí)內(nèi)完成流式檢測，能在當(dāng)日完成流式檢測。
5. 流式檢測和分析：用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長488nm波長處檢測紅色熒光，同時(shí)檢測光散射情況。采用適當(dāng)分析軟件進(jìn)行細(xì)胞DNA含量分析和光散射分析。