懸浮培養(yǎng)細(xì)胞傳代步驟

絕大多數(shù)有限細(xì)胞系、連續(xù)細(xì)胞系的原代培養(yǎng)都是貼壁依賴的，因此依附于某一表面形成單細(xì)胞層。但是還有一些細(xì)胞，特別是來源于血液系統(tǒng)或某些特定腫瘤組織的細(xì)胞，是不依賴于貼壁的，懸浮生長。

懸浮細(xì)胞培養(yǎng)與單層細(xì)胞培養(yǎng)相比有很多優(yōu)點(diǎn)。其中zui大的優(yōu)勢是，傳代時(shí)只需要對細(xì)胞進(jìn)行稀釋即可，由于不存在蛋白水解酶、機(jī)械力等造成的創(chuàng)傷，傳代后基本不會(huì)影響細(xì)胞生長速率。此外，懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞能充分利用培養(yǎng)空間，而且能夠非常直觀觀察到細(xì)胞規(guī)模擴(kuò)大。細(xì)胞可以在類似于培養(yǎng)酵母菌或細(xì)菌的發(fā)酵罐樣的生物反應(yīng)器內(nèi)大規(guī)模擴(kuò)增。

根據(jù)細(xì)胞類型不同，懸浮培養(yǎng)的接種密度通常介于2× 104 cells/ml到5 × 105 cells/ml之間，有些細(xì)胞甚至可以達(dá)到2 x 106 cells/ml。如果細(xì)胞接種密度過低，他們將經(jīng)歷一個(gè)生長停滯期，細(xì)胞生長十分緩慢甚至全部死亡。但是如果接種密度過高的話，細(xì)胞會(huì)很快將培養(yǎng)基內(nèi)的營養(yǎng)成分耗竭，然后突然死亡。請參照說明書了解推薦接種密度、傳代比例、培養(yǎng)基更換時(shí)間表以及推薦使用的培養(yǎng)基等具體信息。

懸浮培養(yǎng)細(xì)胞傳代步驟：

1．事先將*培養(yǎng)基自冰箱內(nèi)拿出，平衡至室溫。

2．使用移液槍吹打重懸培養(yǎng)在靜置培養(yǎng)容器內(nèi)的細(xì)胞，使細(xì)胞懸液充分混勻。取適量細(xì)胞懸液用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞密度。

3. 根據(jù)說明書推薦的zui低接種密度及步驟2算出的細(xì)胞密度，計(jì)算需要接種到新培養(yǎng)容器內(nèi)的細(xì)胞懸液體積以及需要加入的新鮮培養(yǎng)基的量。

4. 在新的培養(yǎng)容器內(nèi)加入步驟3計(jì)算出的所需添加的新鮮培養(yǎng)基及細(xì)胞懸液。如有必要，可在培養(yǎng)容器內(nèi)充滿無菌過濾的CO2，封好培養(yǎng)容器并置于合適的溫度下孵育培養(yǎng)。

5. 通常情況下，換液時(shí)不需要每次都*更換成新的培養(yǎng)基，除非細(xì)胞密度非常高或者是培養(yǎng)基的pH偏酸性（培養(yǎng)基顏色偏黃）。如需*更換培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸液在125g離心力下離心10 min，吸棄舊培養(yǎng)基，然后使用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。