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特邀：華南理工大學生物科學與工程學院周婷課題組

課程組簡介：周婷副教授于2012年入職華南理工大學生物科學與工程學院，學術研究領域聚焦于手性藥物分析、手性藥物立體選擇性代謝及手性轉化研究、代謝組學、脂質組學、生物樣品前處理-色譜質譜聯用等系統(tǒng)的研發(fā)。目前已在《Analytical Chemistry》，《Journal of Chromatography A》等雜志發(fā)表近40篇論文。

導讀

超臨界流體萃取-超臨界流體色譜（SFE-SFC）系統(tǒng)因使用二氧化碳（CO2）作為溶劑，具有價格低廉、無毒和臨界點易于實現的優(yōu)點。但為了提高萃取效率，需要提高SFE的萃取溶劑強度，當這些溶劑被轉移到SFC時，又會引起弱保留物質的峰展寬。

為此，島津和華南理工大學生物科學與工程學院周婷老師課題組合作，創(chuàng)新性的開發(fā)了變壓聚焦超臨界流體選擇性萃取色譜方法（PCF-SFSEC），該法擁有選擇性萃取、變壓聚焦兩大亮點，可以分析水性基質，并且允許大體積進樣分析，有效地解決了峰展寬和靈敏度損失的問題。此外該方法不需要對儀器硬件部分進行任何改造，可與三重四極桿和飛行時間質譜聯用，實現對于少量體積的復雜樣品中的痕量目標物的在線分析。該結果發(fā)表在了分析化學領域影響力最高的期刊《Analytical Chemistry》上。

島津在線SFE-SFC聯用系統(tǒng)（Nexera UC系統(tǒng)）

摘要譯文：

樣品制備與色譜的在線耦合技術是分析化學中的前沿課題，因為它最小化了樣品損失引起的誤差，縮短了分析時間，并減少了溶劑消耗。本研究開發(fā)了一種在線壓力變化聚焦超臨界流體選擇性萃取色譜（PCF-SFSEC）技術，僅使用微升規(guī)模的樣品即可在一次運行中實現萃取、純化、分離和檢測。壓力變化聚焦策略通過降低超臨界流體的溶解能力實現了柱頭堆疊，從而能夠將萃取劑大量引入超臨界流體色譜，而不會導致峰展寬或失真。所有提取物都可以直接引入色譜系統(tǒng)，而無需分流。

基于超臨界流體選擇性萃?。?/span>SFSE）策略，吸附劑去除了樣品中的干擾和水分，有效地減輕了基質效應，實現了直接水樣品分析。通過對大鼠血漿中22種手性藥物的對映選擇性分析，證明了在線PCF-SFSEC的有效性，這些藥物涵蓋了八類具有不同藥理作用的藥物。整個分析耗時25分鐘，僅消耗5μL樣品。PCF-SFSEC中的所有分析物都獲得了分辨率高于1.0的尖銳和對稱的峰，86%的分析物的分辨率高于1.5。定量限（LOQ）范圍為0.0600至32.1μg/L?；厥章试?5.8−117.2%的范圍內。此外，與傳統(tǒng)方法相比，開發(fā)的方法獲得了更令人滿意的重復性，并顯著降低了基質效應。新建立的在線PCF-SFSEC技術被認為是復雜樣品手性分析的綠色和有力工具。

兩處創(chuàng)新 解決難題

變壓聚焦

在傳統(tǒng)的SFE-SFC中，由于萃取物的引入量過大，使用SFE-SFC分析弱保留分析物時，峰展寬和失真非常明顯，當使用高比例強改性劑時，問題更為嚴重。為了解決這個問題，通常需要一種分流策略來減少引入SFC的萃取物量，但同時也導致樣品大量損失，從而降低了靈敏度和重復性。

PCF-SFSEC創(chuàng)新性地引入變壓聚焦（pressure change focusing, PCF）技術：因CO2的溶解能力與其密度成正比，密度受系統(tǒng)壓力的影響，因此通過調節(jié)CO2的壓力從而改變其溶解能力來實現分析物在柱頭的堆積。系統(tǒng)壓力越低，CO2的溶解力越弱，萃取物中的分析物在上樣過程中的擴散急劇減少，反而聚焦在色譜柱頭，當萃取物引入完成后，提高壓力重新形成超臨界流體CO2進行高效分離，因此能夠獲得尖銳對稱的峰。此過程中無需分流，因此靈敏度和重復性得到保障。

應用PCF技術（A）和傳統(tǒng)無PCF技術（B）的樣品裝載過程示意圖

選擇性萃取 

在分析復雜生物樣品時，SFE往往缺乏選擇性，因而基質效應比傳統(tǒng)液-液萃取方法更顯著，此外由于超臨界CO2與水之間的不兼容性，導致SFE無法直接分析水性樣品。受到分散固相萃取技術的啟發(fā)，我們在萃取罐內引入吸附劑，用來吸附雜質和脫水，有效地富集了分析物。

選擇性吸附示意圖

成果展示 多種手性藥物的分析

將開發(fā)的PCF-SFSEC應用于血漿中22種手性藥物的分析，并與傳統(tǒng)在線方法進行比較，展現出顯著優(yōu)勢：

優(yōu)勢一：顯著減少峰展寬

PCF-SFSEC有效減少了大量萃取劑導致的分析物在色譜柱中的擴散現象，無需分流便可獲得清晰對稱的色譜峰，而在常規(guī)SFE-SFC中有50%的手性藥物表現出明顯的譜帶展寬，并且分離度與之相比也稍顯遜色。

在線PCF-SFSEC系統(tǒng)（A）和傳統(tǒng)在線SFE-SFC系統(tǒng)（B）目標物色譜圖

優(yōu)勢二：基質效應明顯減少 

選擇AI2O3作為吸附劑，如圖所示，對于第一個洗脫的對映異構體，22種手性藥物中有17種在PCF-SFSEC中的基質效應低于SFE-SFC。此外，在新系統(tǒng)下22種手性藥物中有18種表現出輕微的基質效應（-30至30%），3種手性藥物表現出中等基質效應（-60至-30%和30至60%），只有一種手性藥物表現出強基質效應（<-60%和>60%）。相比之下，13種手性藥物在在線SFE-SFC中具有中度和強烈的基質效應，這充分驗證了PCF-SFSEC在去除干擾方面的有效性。

PCF-SFSEC（紅色）和傳統(tǒng)SFE-SFC（黑色）洗脫的第一個異構體的基質效應

優(yōu)勢三：無需分流，顯著提高靈敏度

PCF策略允許將所有的萃取物引入色譜柱中分析，減少了樣品損失，使得靈敏度提高，那么效果如何呢？我們將本研究中的樣品消耗量與文獻中在線手性分離方法進行了比較。如表1所示，PCF-SFSEC和以前的在線手性分離方法均獲得了µg/L水平的定量限，但相比之下，先前研究中使用的樣品量（20–100 µL）卻是本研究（5 µL）的4–20倍。

在線手性分離方法對比

專家心聲

華南理工大學生物科學與工程學院，周婷副教授

華南理工大學生物科學與工程學院周婷副教授表示，島津的SFE-SFC系統(tǒng)（Nexera-UC）是一個強有力的分析工具。本文介紹的PCF-SFSEC技術正是基于該系統(tǒng)原有強大硬件和功能的基礎上，做方法設置上的創(chuàng)新優(yōu)化，最后得到的結果優(yōu)異，并發(fā)表在《Analytical Chemistry》上，證明Nexera-UC系統(tǒng)結合PCF-SFSEC技術，開拓了SFC領域的又一較大的發(fā)展空間，具有廣泛的應用前景。

撰稿人：鐘啟升

參考文獻：Jieqing Feng, etc., Anal. Chem. 2022, 94(46), 16222-16230.

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