化工儀器網(wǎng)
詳細介紹
重組蛋白純化系統(tǒng)Target tag/PA tag?
◆TARGET 標簽系統(tǒng) 標簽序列【(YPGQ)5V】
● 通過樹脂再生，降低運作成本
● 溫和洗脫、清洗，實現(xiàn)高純度
● 在動物細胞表達系（HEK293T細胞、CHO細胞等）中有效純化蛋白
TARGER標簽系統(tǒng)使用的是可識別肽標簽（21個氨基酸殘基）的單抗（P20.1），是日本開發(fā)的親和純化標簽系統(tǒng)。
TARGET標簽系統(tǒng)實踐證明，即使在傳統(tǒng)系統(tǒng)都難以進行高純度蛋白純化的動物細胞表達系中，也可有效地進行親和純化。
TARGET標簽系統(tǒng)
A rapid screening method for cell lines producing singly-tagged recombinant proteins using the“ TARGET tag”system. Tabata S. et al., J. Proteomics, 2010 Aug 5;73(9):1777-85.
TARGET 標簽表達載體示意圖
產(chǎn)品選擇
載體 | 表達模式 | 宿主細胞 | MCS啟動子 |
pEBMulti | 非整合型穩(wěn)定表達 | 靈長類（人、猴）、狗細胞等貼壁細胞 | CAG |
pCAG | 瞬時表達 | 靈長類（人、猴）、狗細胞等貼壁細胞、大/小鼠等動物細胞 | CAG |
和光還推出除上述抗性基因載體外的其他載體。（請點擊查看）
測序用引物序列、其他載體序列的相關(guān)詳細信息，已附在產(chǎn)品隨貨說明書中。
另外可點擊和光主頁/TARGET標簽，查看序列信息、多克隆位點(MCS)信息。
TARGET標簽融合蛋白的免疫沉淀
| 通過Transient 載體， 表達TARGET標簽融合重組蛋白
|
培養(yǎng)上清（培養(yǎng)第7天） 每10 mL中，分別添加0.1 mL（net 0.05 mL）的抗體磁珠（①抗TARGET標簽抗體瓊脂糖珠、②抗DYKDDDDK標簽抗體瓊脂糖珠，其他公司產(chǎn)品），4℃條件下，進行2小時免疫沉淀。 清洗后，在回收的各珠中分別添加0.5 mL 0.2 mg/mL TARGET標簽肽/TBS和0.2 mg/mL DYKDDDDK肽/TBS，4℃條件下，平穩(wěn)震動0.5小時。離心后回收上清。 再分別在各珠中添加0.5 mL 0.1 M Glycine-HCl (pH 2.7)，室溫下，平穩(wěn)震動5分鐘。離心后，回收上清并用1M Tris-HCl (pH 9.0)中和。 上圖為SDS-PAGE處理后的銀染結(jié)果。 與傳統(tǒng)DYKDDDDK tag相比，背景更低 →高純度！ | M：M.W. Marker 1.僅轉(zhuǎn)染載體的培養(yǎng)上清 2.轉(zhuǎn)染了蛋白Y-TARGET 標簽表達質(zhì)粒的細胞培養(yǎng)上清 3.轉(zhuǎn)染了TARGET標簽-蛋白Y 表達質(zhì)粒的細胞培養(yǎng)上清 也可使用市售的Transient載體 |
確認非整合型載體TARGET tag C端融合重組蛋白的表達 | |
利用可編碼表達人源生理活性蛋白基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293N細胞后，從初期細胞數(shù)3×10^5cells/mL開始培養(yǎng)，回收0/3/7日的培養(yǎng)上清。 用20μL/lane的培養(yǎng)上清進行SDS-PAGE處理，通過銀染和Western blotting，檢測出蛋白的表達。 |
|
可確認到與市面售賣的Tag系統(tǒng)有相同的表達量和檢測靈敏度。 | |
TARGET 標簽系列
產(chǎn)品名稱 | 子類 | 適用 實驗 | 規(guī)格 | 產(chǎn)品編號 | 包裝 | |
單抗 | ||||||
抗TARGET標簽, 單抗 | 小鼠IgG1 | IP, WB | 免疫化學(xué)用 | 016-25481 | 200 μg | |
012-25483 | 1 mg | |||||
HRP標簽單抗 | ||||||
抗TARGET tag, 單抗, 過氧化酶結(jié)合 | 小鼠IgG1 P20.1 | WB | 免疫化學(xué)用 | 015-25571 | 200 μL | |
011-25573 | 1 mL | |||||
產(chǎn)品名稱 | 子類克隆號 | 規(guī)格 | 產(chǎn)品編號 | 包裝 | |||||
抗體結(jié)合瓊脂糖珠 | |||||||||
抗TARGET標簽抗體瓊脂糖珠 | 小鼠IgG1 P20.1 | 免疫化學(xué)用 | 018-25561 | 2 mL (Net 1 mL) | |||||
| 014-25563 | 10 mL (Net 5 mL) | ||||||||
| 012-25564 | 50 mL (Net 25 mL) | ||||||||
識別N端、C端的TARGET標簽 使用載體：4%瓊脂糖 | |||||||||
產(chǎn)品名稱 | 備注 | 規(guī)格 | 產(chǎn)品編號 | 包裝 |
肽 | ||||
TARGET標簽肽 | 含量（HPLC）95%以上 | 基因研究用 | 200-19673 | 5 mg |
208-19674 | 25 mg | |||
清洗液 | ||||
TARGET標簽清洗液 | 已過濾消毒 | 基因研究用 | 208-19831 | 50 mL |
產(chǎn)品名稱 | 可選Marker | 產(chǎn)品編號 | 包裝 | ||
大腸桿菌 | 動物細胞 | ||||
瞬時表達載體 | |||||
C端插入TARGET標簽的pCAG-Ble載體 | 博萊霉素 | 165-26381 | 20 μg | ||
N端插入TARGET標簽的pCAG-Ble載體 | 博萊霉素 | 162-26391 | 20 μg | ||
C端插入TARGET標簽的pCAG-Bsd載體 | 殺稻瘟素S | 165-26401 | 20 μg | ||
N端插入TARGET標簽的pCAG-Bsd載體 | 殺稻瘟素S | 162-26411 | 20 μg | ||
C端插入TARGET標簽的pCAG-Hyg載體 | 潮霉素B | 169-26421 | 20 μg | ||
N端插入TARGET標簽的pCAG-Hyg載體 | 潮霉素B | 166-26431 | 20 μg | ||
C端插入TARGET標簽的pCAG-Neo載體 | 卡那霉素 | G418 | 163-26441 | 20 μg | |
N端插入TARGET標簽的pCAG-Neo載體 | 卡那霉素 | G418 | 160-26451 | 20 μg | |
游離載體 | |||||
C段插入TARGET標簽的pEBMulti-Ble載體 | 博來霉素 | 167-26461 | 20 μg | ||
N段插入TARGET標簽的pEBMulti-Ble載體 | 博來霉素 | 164-26471 | 20 μg | ||
C段插入TARGET標簽的pEBMulti-Bsd載體 | 殺稻瘟素S | 161-26481 | 20 μg | ||
N段插入TARGET標簽的pEBMultI-Bsd載體 | 殺稻瘟素S | 168-26491 | 20 μg | ||
C段插入TARGET標簽的pEBMulti-Hyg載體 | 潮霉素B | 161-26501 | 20 μg | ||
N段插入TARGET標簽的pEBMulti-Hyg載體 | 潮霉素B | 168-26511 | 20 μg | ||
C段插入TARGET標簽的pEBMulti-Neo載體 | 卡那霉素 | G418 | 165-26521 | 20 μg | |
N段插入TARGET標簽的pEBMulti-Neo載體 | 卡那霉素 | G418 | 162-26531 | 20 μg | |
C段插入TARGET標簽的pEBMulti-Puro載體 | 氨芐青霉素 | 嘌呤霉素 | 169-26541 | 20 μg | |
N段插入TARGET標簽的pEBMulti-Puro載體 | 氨芐青霉素 | 嘌呤霉素 | 166-26551 | 20 μg | |
◆PA標簽系統(tǒng) 標簽序列【GVAMPGAEDDVV】
● 通過樹脂再生，降低運行成本
● 超高親和性抗體，實現(xiàn)高回收率、高純度純化
● 在動物細胞表達系（HEK293T細胞、CHO細胞等）中，有效純化蛋白
● PA標簽系統(tǒng)是使用可識別肽標簽（12個氨基酸殘基）的單抗（NZ-1）。日本開發(fā)的親和性純化標簽系統(tǒng)。
● NZ-1單抗對PA tag具有高親和性和特異性，可應(yīng)用于Western Blotting、細胞流式分析、免疫組化（ICC）。
通過免疫沉淀，可純化PA標簽融合蛋白以及樹脂再生。
● PA標簽系統(tǒng)，可一步純化高純度PA標簽融合蛋白。
PA標簽系統(tǒng)
Fujii, Y. et al., "PA tag: A versatile protein tagging system using a super high affi nity antibody against a dodecapeptide derived from human podoplanin.", Protein Exp. Purif., 95, 240-247(2014).
Fujii, Y. et al.
新型親和標簽系統(tǒng)“PA tag”的應(yīng)用方法~蛋白的純化及檢測~
蛋白科學(xué)學(xué)會檔案, 7, e075 (2014)
PA標簽表達載體案例
載體 | 表達模式 | 宿主細胞 | MCS啟動子 |
pCAG | 瞬時表達 | 靈長類（人、猴）、犬細胞等粘著細胞 | CAG |
和光還推出除上述抗性基因載體外的其他載體。（請點擊參考。）
測序用引物序列、其他載體序列的相關(guān)詳細信息，已附在產(chǎn)品現(xiàn)貨說明書中。
另外可點擊和光主頁/TARGET標簽，查看序列信息、Multi Cloning Site(MCS)信息。
用PA標簽從培養(yǎng)上清中親和提純的案例
數(shù)據(jù)提供：大阪大學(xué) 蛋白研究所附屬蛋白分析*研究中心
分子創(chuàng)制學(xué)研究室 高木淳一老師，藤井勇樹老師
Protocol 目的蛋白的純化
１．哺乳類動物細胞轉(zhuǎn)染(HEK293T)
轉(zhuǎn)染處于40-60%融合狀態(tài)的細胞
培養(yǎng)基：D-MEM, 5%FBS
２．回收培養(yǎng)上清和吸附蛋白樹脂
轉(zhuǎn)染48-72小時后，回收約420 mL培養(yǎng)上清，加入8 mL抗PA標簽抗體瓊脂糖珠，混合2小時（2-10℃）
３．樹脂回收
用50 mL的純化柱。回收步驟2)中的瓊脂糖珠
４．樹脂洗滌
加入珠4倍量的TBS 緩沖液（20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl），清洗5次
５．PA標簽肽從樹脂中競爭性洗脫
加入經(jīng)1×TBS溶液, pH 7.5溶解過的PA 標簽肽（終濃度0.1 mg/mL），體積量需為珠的一倍，
然后分10次回收PA標簽融合蛋白X
６．SDS-PAGE
樣品量
c. sup：5 μL, flow through：5 μL, wash：5 μL,
肽洗脫（1-10）：各10 μL
可純化PA標簽融合蛋白X且不依賴PA標簽。→可實現(xiàn)*純度的親和純化。
通過PA tag降低背景的方法
| M: Marker |
在20 mL的昆蟲細胞溶解液中加入蛋白Z，使其濃度變?yōu)?.0 mg/L后，添加200 μL抗PA標簽抗體瓊脂糖珠，4℃溫度條件下，攪拌3小時。
分別用不同濃度的TBS溶液（0.15 M、0.5 M、1.0 M NaCl）進行調(diào)整，用瓊脂糖珠50倍量清洗。在回收的各珠中加入0.5 mL 0.1 M Glycine-HCl(pH 2.7)，室溫條件下平穩(wěn)震動5 min。
離心后回收上清，用1 M Tris-HCl (pH 9.0)做中和處理。
SDS-PAGE后進行銀染，比較去除污染蛋白之后，不同濃度下的結(jié)果。
使用案例：Western Blotting
地域革新領(lǐng)域 加藤 幸成老師，金子 美華老師 NZ-1顯示出與天然抗體具有相同的高檢測靈敏度。 | Lane 1 一抗：抗IDH1抗體（RcMab-1）, 1 μg/mL 二抗：抗大鼠IgG-HRP標簽, 1000倍稀釋 一抗：抗PA tag抗體, 1 μg/mL 二抗：抗大鼠IgG-HRP標簽, 1000倍稀釋 一抗：抗DYKDDDDK標簽抗體, 3.5 μg/mL 二次抗體：抗小鼠IgG-HRP標簽, 1000倍稀釋 |
PA標簽系列
產(chǎn)品名稱 | 子類克隆號 | 適用實驗 | 規(guī)格 | 產(chǎn)品編號 | 包裝 |
單抗 | |||||
抗PA標簽, 大鼠單抗 | 大鼠IgG2a | IP, WB, FCM, ICC | 免疫化學(xué)用 | 016-25861 | 200 μL |
012-25863 | 1 mL | ||||
HRP標簽單抗 | |||||
抗PA標簽, 大鼠單抗,過氧化酶結(jié)合 | 大鼠IgG2a NZ-1 | WB | 免疫化學(xué)用 | 015-25951 | 200 μL |
011-25953 | 1 mL | ||||
產(chǎn)品名稱 | 子類克隆號 | 規(guī)格 | 產(chǎn)品編號 | 包裝 |
抗體結(jié)合瓊脂糖珠 | ||||
抗PA標簽抗體瓊脂糖珠 | 大鼠IgG2a NZ-1 | 免疫化學(xué)用 | 012-25841 | 2 mL(Net 1 mL) |
018-25843 | 10 mL (Net 5 mL) | |||
016-25844 | 50 mL (Net 25 mL) | |||
識別N端、C端的PA標簽 | ||||
抗體結(jié)合磁珠 | ||||
MagCaptureTM HP 抗PA標簽抗體磁珠 | 大鼠IgG2a NZ-1 | 免疫化學(xué)用 | 137-18751 | 2 mL |
溶液組成：1×TBS(pH 7.4), 50% glycerol, 0.05 w/v% sodium azide | ||||
產(chǎn)品名稱 | 備注 | 規(guī)格 | 產(chǎn)品編號 | 包裝 |
肽 | ||||
PA標簽肽 | 含量（HPLC）95%以上 | 基因研究用 | 167-25501 | 5 mg |
163-25503 | 25 mg | |||
清洗溶液 | ||||
PA標簽清洗溶液 | 已過濾消毒 | 基因研究用 | 169-27261 | 50 mL |
產(chǎn)品名稱 | 可選Marker | 產(chǎn)品編號 | 包裝 | |
大腸桿菌 | 動物細胞 | |||
瞬時載體 | ||||
pCAG-Ble PA 標簽-C | Bleomycin | 161-26861 | 20 μg | |
pCAG-Ble PA 標簽-N 信號 增加型 | Bleomycin | 168-26871 | 20 μg | |
pCAG-Bsd PA 標簽-C | Blasticidin S | 165-26881 | 20 μg | |
pCAG-Bsd PA 標簽-N 信號 增加型 | Blasticidin S | 162-26891 | 20 μg | |
pCAG-Neo PA 標簽-C | Hygromycin B | 165-26901 | 20 μg | |
pCAG-Hyg PA 標簽-N 信號 增加型 | Hygromycin B | 162-26911 | 20 μg | |
pCAG-Neo PA 標簽-C | Kanamycin | G418 | 169-26921 | 20 μg |
pCAG-Neo PA 標簽-N 信號 增加型 | Kanamycin | G418 | 166-26931 | 20 μg |
化工儀器網(wǎng)