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Western Blotting老踩坑？一篇搞定常見問題
閱讀：195 發(fā)布時間：2024-4-16
◆Western Blotting實驗失敗緣由？
Western Blotting是生命科學研究的基礎實驗方法，實驗中的蛋白量、抗體、凝膠、膜和檢測反應等因素均可能導致實驗失敗，但初學者往往不知道原因所在。 “我不知道Western Blotting失敗的原因是什么“ “我想知道解決方案！“ 針對Western Blotting的各種問題，本文整理了在轉(zhuǎn)膜、抗體反應、檢測等過程中的常見問題及解決方案。 |
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◆Western Blotting常見的失敗案例
以下為Western Blotting常見的失敗案例：
● 高背景
● 出現(xiàn)微笑條帶或扭曲條帶
● 出現(xiàn)漫反射帶
● 轉(zhuǎn)膜不均勻
下面將分別介紹它們的原因及相應的解決方案。
高背景
原因 | 解決方案 |
洗滌不充分 | ● 增加洗滌次數(shù) ● 增加洗液體積 ● 延長洗滌時間 ● 確認Tween® 20 (*)濃度 |
無法阻斷非特異性結合 | ● 重新調(diào)節(jié)封閉溫度和時間。室溫下1 h，4℃下過夜 ● 添加Tween® 20 (*) ● 使用添加Tween® 20 (*)的封閉緩沖液（TBS-T、PBS-T） ● 使用高靈敏度發(fā)光試劑（Immunostar® 系列） |
膜處理不當 | ● 對膜進行必要的前處理 ● 使用干凈的鑷子和手套，注意不要損壞膜。 ● 孵育時振蕩 ● 使用低背景且可高靈敏度檢測靶蛋白的CLEARTRANS® 系列產(chǎn)品 |
因設備、器皿的污垢造成的污染 | ● 充分清洗轉(zhuǎn)膜裝置、電泳槽等設備，操作過程中佩戴手套 |
強化學發(fā)光信號 | ● 縮短檢測的曝光時間 ● 縮短檢測試劑的反應時間 ● 降低檢測試劑的濃度 |
(*) ICI Americans社的注冊商標
出現(xiàn)微笑條帶和扭曲條帶
原因 | 解決方案 |
電壓過高發(fā)熱 | ● 降低電壓進行電泳 |
鹽濃度不同 | ● 鹽濃度越高，移動速度越快，需統(tǒng)一樣品的鹽濃度 |
上樣量不同 | ● 統(tǒng)一各個孔的上樣量 |
有空孔 | ● 在空孔中上樣相同鹽濃度、相同液量的樣品，或僅上樣樣品緩沖液 |
出現(xiàn)漫反射帶
| 原因 | 解決方案 |
| 受到樣品溶液中變性劑和表面活性劑的影響 | ● 確認樣品的提取和制備過程 |
樣品存放時間久，存儲方法不當， 導致蛋白降解 | ● 確認樣品的制備時間和存儲方法 |
| 轉(zhuǎn)膜時間過短 | ● 如果所有條帶出現(xiàn)相同現(xiàn)象，可能是轉(zhuǎn)膜時間短，需要延長轉(zhuǎn)膜時間 |
| 蛋白量過高 | ● 調(diào)整蛋白上樣量和濃度 |
轉(zhuǎn)膜不均勻
原因 | 解決方案 |
凝膠和膜之間有氣泡 | ● 使用滾筒等去除氣泡 |
轉(zhuǎn)膜設備的問題 | ● 使用半干式設備時，反復使用會導致轉(zhuǎn)膜板彎曲，建議返廠維修或更換 新的設備 |
轉(zhuǎn)膜方法的問題 | ● 半干式設備容易引起轉(zhuǎn)膜不均勻的問題，可嘗試更換為濕轉(zhuǎn)儀 |
◆其他失敗案例的原因及解決方案
其他的失敗原因、解決方案如下所示。
● 條帶模糊、不清晰
● 條帶空白
● 信號弱、無信號
● 背景有斑點和污漬
● 麗春紅染色效果差
下面將分別介紹它們的原因及相應的解決方案。
條帶模糊、不清晰
原因 | 解決方案 |
蛋白量過高 | ● 降低電泳的蛋白量 |
抗體濃度高 | ● 降低一抗、二抗的濃度 |
檢測信號高 | ● 縮短曝光時間 ● 縮短檢測試劑的反應時間，反應后盡可能去除試劑 ● 降低二抗?jié)舛?/span> |
條帶空白
原因 | 解決方案 |
蛋白量高 | ● 減少蛋白量 |
抗體濃度高 | ● 降低一抗、二抗的濃度 |
信號弱、無信號
原因 | 解決方案 |
抗體失活 | ● 檢查抗體存儲狀態(tài)，時間 ● 重新進行抗體反應時，推薦使用10 min即可去除抗體的“WB膜再生液“ |
抗體結合力不足 | ● 確認抗體的稀釋濃度是否合適 ● 延長抗體反應時間 ● 對于低蛋白表達量的樣品，可增加電泳量，提高抗體濃度 ● 使用抗原抗體反應促進試劑 ● 更換高效轉(zhuǎn)膜緩沖液 |
疊氮-化鈉抑制酶反應 | ● 疊氮-化鈉會抑制HRP的活性，因此抗體中含疊氮-化鈉時，需要稀釋抗體 以降低疊氮-化鈉濃度或使用不含疊氮-化鈉的抗體 ● 使用HRP標記一抗且阻斷劑中含有疊氮-化鈉時，需在封閉后使用 TBS-T 清洗再進行抗體反應 |
曝光時間短 | ● 延長曝光時間 |
封閉時間不當 | ● 封閉時間過長時，封閉劑會遮蓋抗原，降低抗體反應性，因此需要確認封 閉時間是否合適 |
轉(zhuǎn)膜效率低，無法轉(zhuǎn)膜 | ● 延長轉(zhuǎn)膜時間 ● 靶蛋白的分子量較高時(例：100 kD以上)，添加0.1%的SDS(十二烷基硫 酸鈉) ● 使用預染蛋白Marker作為陽性對照，確認轉(zhuǎn)膜效率 ● 使用具有抗體結合位點的分子量Marker作為陽性對照 |
檢測試劑的化學發(fā)光弱 | ● 確認檢測試劑是否變質(zhì) ● 使用高靈敏度的發(fā)光試劑“ImmunoStar®系列“ |
背景可見斑點和污漬
原因 | 解決方案 |
鑷子被污染 | ● 鑷子上的污垢會附著在膜上形成背景。需使用經(jīng)乙醇消毒后的干凈鑷子 夾住膜的邊緣 |
洗滌不充分 | ● 增加洗滌次數(shù)和洗液體積 |
抗體反應不當 | ● 增加抗體反應溶液，并振蕩使其反應 |
檢測設備被污染 | ● 檢測前，使用乙醇擦拭放置膜的樣品臺，去除污垢 |
麗春紅染色效果差
原因 | 解決方案 |
蛋白未轉(zhuǎn)膜 | ● 確認轉(zhuǎn)膜設備是否正確運行 ● 確認膜和凝膠是否正確接觸 |
低蛋白量 | ● 增加蛋白的上樣量 |
染色試劑變質(zhì) | ● 檢查染色試劑的有效期 ● 更換凝膠染色試劑（Negative Gel Stain MS Kit、Ponceau 3R、 Ponceau-3R StainSolution、Amido Black 10B） |
◆Western blotting推薦產(chǎn)品
● 封閉用脫脂奶粉 ● 高效轉(zhuǎn)膜液 ● 預染蛋白Marker ● 抗原抗體反應加速試劑 Immuno-enhancer ● WB專用膜 ● 過氧化物酶發(fā)光底物 |
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參考文獻
● Rasheed Sule. et al. : Future Science., 75, 99 (2023)
● Habeebunnisa Begum. et al. : Future Science., 73, 58 (2022)
● 岡田雅人, 三木裕明, 宮崎香：「無·敵のバイオテクにカルシリーズ 改訂第4版 タンパク質(zhì)実験ノート 下」p.44 (羊土社)
● 西方敬人：「バイオ実験イラストレイテッド⑤」p.165 (秀潤社)