DH10B-Plus Electroporation-Competent Cell

產(chǎn)品規(guī)格

DH10B-Plus                       50μl/支

pUC19 (control vector，10pg/μl):                                        10μl

保存條件(保質(zhì)期)：                                                 -80℃（6個月）

基因型

F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) ?80lacZΔM15ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu)7697 galE15 galK λ-rpsL nupG Hte(Tet^R)

DH10B-Plus Electroporation-Competent Cell產(chǎn)品說明

DH10B-Plus電擊感受態(tài)細胞只能用于電擊轉(zhuǎn)化，不能用于熱激轉(zhuǎn)化。DH10B-Plus菌株來源于DH10B菌株，在DH10B菌株中引入Hte突變，提高了細胞膜的通透性和對瞬時高壓的耐受進而提高了電擊轉(zhuǎn)化效率。DH10B- Plus菌株適合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA (無論真核生物還是原核生物的基因組DNA都能被高效的轉(zhuǎn)入DH10B- Plus中)。recA1和endA1的突變有利于插入DNA的穩(wěn)定和高純度質(zhì)粒DNA的提取，?80dlacZ ΔM15標記的存在使DH10B-Plus可用于藍白斑篩選。DH10B-Plus電擊感受態(tài)細胞具有鏈霉素和四環(huán)素抗性，適用于大質(zhì)粒的構(gòu)建或各種文庫構(gòu)建，經(jīng)特殊工藝處理，pUC19質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率>2×10¹⁰ cfu/μg DNA。

操作方法

1. 0.1 cm 電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實冰面，電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。

2. 取-80℃保存的DH10B-Plus電擊感受態(tài)細胞插入冰中5 分鐘，待其融化，加入目的DNA (質(zhì)粒或連接產(chǎn)物)并用手打EP管底輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，立即插入冰中。

        A. 測定轉(zhuǎn)化效率使用1 μl 10 pg/μl的對照質(zhì)粒 pUC19；

        B. 對于連接產(chǎn)物，大部分公司的T4連接酶反應(yīng)體系或50度反應(yīng)重組體系可與DH10B-Plus電擊感受態(tài)混合后電擊轉(zhuǎn)               化，無需進行DNA純化，但DNA濃度不能過高，DNA濃度不超過100 ng/μl，體積不超過5 μl/50 μl感受態(tài)。

        C. 對鹽濃度較高的DNA溶液或反應(yīng)體系請用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM                   EDTA)重懸，然后與DH10B-Plus電擊感受態(tài)混合進行電擊轉(zhuǎn)化。

3. 用200 μl槍頭(用刀切除0.5cm槍尖)將感受態(tài)-DNA混合物快速移到電擊杯中，避免產(chǎn)生氣泡，蓋上杯蓋。

4. 啟動電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置參數(shù)：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此為BioRad 電轉(zhuǎn)儀推薦參數(shù)，也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的參數(shù)操作），將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中，電擊完成快速插入冰中。

5. 2分鐘后從冰中取出電擊杯，放室溫，加入700 μl不含抗生素的無菌S.O.C. 培養(yǎng)基（室溫），用1ml 槍吹吸電擊杯底部數(shù)次混勻后，轉(zhuǎn)移到50 ml離心管（BD Falcon 50 ml錐形離心管等），向離心管中補加S.O.C. 培養(yǎng)基至10 ml。37℃，225 rpm復(fù)蘇60分鐘。

6. 5000 rpm離心一分鐘收菌，重懸后取100-200 μl涂布到含相應(yīng)抗生素的S.O.C平板上（因菌量較大，若全部涂板請選用直徑15cm培養(yǎng)皿2-5個）。將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)13-17小時。