Stable Chemically Competent Cell

產(chǎn)品規(guī)格

Stable：                                                     100μl/支

pUC19 (control vector，10pg/μl):                   10μl

保存條件(保質(zhì)期)：                            -80℃（6個月）

基因型

F' proA+B+ lacI^q ?(lacZ)M15 zzf::Tn10 (Tet^R) ?(ara-leu) 7697 araD139 fhuA ?lacX74 galK16 galE15 e14- Φ80dlacZ?M15 recA1 relA1 endA1 nupG rpsL (Str^R) rph spoT1 ?(mrr-hsdRMS -mcrBC) 

Stable Chemically Competent Cell產(chǎn)品說明

Stable菌株是NEB公司開發(fā)的高轉(zhuǎn)化效率菌株，是逆轉(zhuǎn)錄病毒/慢病毒載體系統(tǒng)推薦使用的菌株，特別適合慢病毒或具有末端重復(fù)序列DNA段的克隆。基因組含有重組酶recA1 rel A1突變，可有效抑制長片段末端重復(fù)區(qū)的重組，降低錯誤重組的概率；同時含有核酸酶endA1突變，避免了提取質(zhì)粒過程中核酸酶的污染，大大提高了高純度病毒質(zhì)粒的產(chǎn)量和質(zhì)量。lacZΔM15的存在使Stable可用于藍(lán)、白斑篩選，此菌株具有四環(huán)素和鏈霉素抗性，Stable感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pUC19檢測轉(zhuǎn)化效率>5×10⁸ cfu/μg DNA。 

操作方法

1. Stable感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，6分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA（質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物）并用手打EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰中靜置25分鐘。

2. 42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置5分鐘，晃動會降低轉(zhuǎn)化效率。

3. 向離心管中加入0.9 mL室溫S.O.C.或LB培養(yǎng)基(S.O.C.營養(yǎng)豐富，可提高轉(zhuǎn)化效率)。

4. 30℃，250 rpm復(fù)蘇60分鐘。

           當(dāng)質(zhì)粒中含有不穩(wěn)定片段時，30℃培養(yǎng)可降低錯誤重組的概率，若轉(zhuǎn)化control pUC19計算轉(zhuǎn)化效率

           則需37℃，225 rpm復(fù)蘇60分鐘

5. 篩選平板提前拿出放30℃孵育使平板溫度保持30℃，吸取50-100 μl直接涂篩選平板或5000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的S.O.C.或LB培養(yǎng)基上。

6. 將平板倒置放于30℃培養(yǎng)20-24小時或37℃過夜培養(yǎng)。

當(dāng)質(zhì)粒中含有不穩(wěn)定片段時，30℃培養(yǎng)可降低錯誤重組的概率，若轉(zhuǎn)化control pUC19計算轉(zhuǎn)化效率，

則需37℃培養(yǎng)過夜

注意事項

1. 對不穩(wěn)定DNA段的克隆或逆轉(zhuǎn)錄病毒/慢病毒載體的構(gòu)建，涂板后平板應(yīng)在30℃培養(yǎng)，以減少發(fā)生錯誤重組的概率

2. 制備高純度病毒質(zhì)粒時，應(yīng)使用新鮮轉(zhuǎn)化的平板接菌，新鮮菌液提取質(zhì)粒，菌液不可低溫保存后使用。

3. 對不穩(wěn)定的克隆或病毒質(zhì)粒優(yōu)先以質(zhì)粒狀態(tài)保存，盡量避免將質(zhì)粒保存在大腸桿菌細(xì)胞中。

4. 感受態(tài)細(xì)胞在冰中緩慢融化。插入冰中10分鐘內(nèi)加入目標(biāo)DNA，不可在冰中放置時間過長，長時間存放會降低轉(zhuǎn)化效率?；烊肽康腄NA時應(yīng)輕柔操作。

5. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒或高效率的連接產(chǎn)物可相應(yīng)減少終用于涂板的菌量。