BJ5183-AD-1 Electroporation-Competent Cell 

產(chǎn)品規(guī)格

BJ5183-AD-1           50μl/支

pCAMBIA2301 (control vector, 10ng/μl):                            10μl

保存條件(保質(zhì)期)：                                                -80℃（6個(gè)月）

基因型

endA1 sbcBC recBC galK met thi-1 bioT hsdR (Str^R) [pAdEasy-1 (Amp^R)] 

BJ5183-AD-1 Electroporation-Competent Cell 產(chǎn)品說(shuō)明

BJ5183-AD-1是攜帶了腺病毒質(zhì)粒pAdeasy-1的BJ5183菌株。BJ5183菌株是一種具有較高重組活力的大腸桿菌菌株，是目前腺病毒系統(tǒng)常用的感受態(tài)細(xì)胞。BJ5183菌株含有sbcBC recBC雙重突變，賦予BJ5183細(xì)胞較強(qiáng)的重組能力，有利于轉(zhuǎn)入的目的基因與腺病毒骨架質(zhì)粒的重組。endA1（缺失核酸內(nèi)切酶）的突變有利于重組DNA的穩(wěn)定和高純度質(zhì)粒DNA的提取。BJ5183-AD-1菌株細(xì)胞中已經(jīng)提前轉(zhuǎn)入了腺病毒質(zhì)粒pAdeasy-1[encodes the Adenovirus-5 genome (E1/E3 deleted)]，賦予該菌株氨芐抗性，在病毒質(zhì)粒構(gòu)建時(shí)，只需轉(zhuǎn)入線性化的目的質(zhì)粒即可，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，提高了病毒質(zhì)粒重組概率。Str^R 賦予BJ5183-AD-1菌株鏈霉素抗性。BJ5183-AD-1電擊感受態(tài)細(xì)胞適用于普通質(zhì)粒和大質(zhì)粒的構(gòu)建，經(jīng)特殊工藝制作，pCAMBIA2301質(zhì)粒(size:1163bp)檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>1×10⁶ cfu/μg DNA。

操作方法

1. 0.1 cm 電擊杯和杯蓋從儲(chǔ)存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，使乙

醇充分揮發(fā)，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實(shí)冰面，電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中

靜置5分鐘充分降溫。

2. 取-80℃保存的BJ5183-AD-1電擊感受態(tài)細(xì)胞插入冰中5分鐘，待其融化，加入目的DNA (質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物)并用手打EP管底輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，立即插入冰中。

A. 測(cè)定轉(zhuǎn)化效率使用1 μl 10 pg/μl的對(duì)照質(zhì)粒pCAMBIA2301；

B. 對(duì)于連接產(chǎn)物，請(qǐng)用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重

懸，DNA濃度不超過(guò)100 ng/μl，體積不超過(guò)5 μl/50 μl感受態(tài)。

3. 用200 μl槍頭(用刀切除0.5cm槍尖)將感受態(tài)-DNA混合物快速移到電擊杯中，避免產(chǎn)生氣泡，蓋上杯蓋。

4. 啟動(dòng)電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置參數(shù)：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此為BioRad 電轉(zhuǎn)儀推薦參數(shù)，也可按所用

電轉(zhuǎn)儀推薦的參數(shù)操作），將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中，電擊完成快速插入冰中。

5. 2分鐘后從冰中取出電擊杯，放室溫，加入700 μl不含抗生素的無(wú)菌S.O.C. 培養(yǎng)基（室溫），用1ml

槍吹吸電擊杯底部數(shù)次混勻后，轉(zhuǎn)移到50 ml離心管（BD Falcon 50 ml錐形離心管等），向離心管中

補(bǔ)加S.O.C. 培養(yǎng)基至10 ml。37℃，225 rpm復(fù)蘇60分鐘。

6. 5000 rpm離心一分鐘收菌，重懸后取100-200 μl涂布到含相應(yīng)抗生素的S.O.C平板上（因菌量較大，

若全部涂板請(qǐng)選用直徑15cm培養(yǎng)皿2-5個(gè)）。將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。