聚丙稀酰胺等電聚焦電泳

目的要求

1、學(xué)習(xí)等電聚焦的原理

2、掌握聚丙烯酰胺等點(diǎn)聚焦電泳操作技術(shù)

實(shí)驗(yàn)原理

    所有的氨基酸均為兩性物質(zhì)，即它們至少含有一個(gè)羧基（carboxyl）及一個(gè)氨基（a-ami-no）。 這些可游離的基團(tuán)隨著pH變化可以三種形式存在，即在電荷（cation）、兩性離子（zwit-terion）及負(fù)電荷（anion）等三種，在酸性溶液中帶正電荷，在堿性溶液中帶負(fù)電荷。若氨基酸在某一pH值下其凈電荷為0，且在電場中不移動(dòng)時(shí)，稱此pH值為它的pI值（等電點(diǎn)）。因?yàn)閮綦姾蔀榱?，凈電斥力不存在的緣故，大部分蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的pH值下，其溶解度zui小。相反的，當(dāng)溶液的pH值低于或高于pI,所有蛋白質(zhì)分子所帶凈電電荷為同號(hào)，彼此之間有相斥力，不會(huì)聚焦。所以，將pH調(diào)到等電點(diǎn)的大小，則大部分的蛋白質(zhì)將會(huì)沉淀，這種現(xiàn)象可以應(yīng)用于估算某蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。另一方面，也可以應(yīng)用在電泳，達(dá)到分離蛋白質(zhì)混合物的目的，這種方法稱為等電聚焦電泳（isoelectric  focusing），簡稱為IEF。

    以A、B兩種蛋白質(zhì)為例，做出它們的凈電荷曲線圖，橫軸代表環(huán)境中的pH值，縱軸代表蛋白質(zhì)的凈電荷，在pH6.5時(shí)，A帶有兩個(gè)正電荷，B帶有一個(gè)負(fù)電荷。使A與B的凈電荷為0的pH值分別為pH9和pH5，這就是它們的等電點(diǎn)。

    IEF是在具有pH梯度環(huán)境中進(jìn)行的電泳。將蛋白質(zhì)置于不同pH梯度的膠體進(jìn)行電泳，它會(huì)朝著與自身所帶電荷相反的電極方向移動(dòng)，直到抵達(dá)等電點(diǎn)（pI）相同的pH值處才停止，如果它移到別的pH處，會(huì)因?yàn)閹щ姸俣纫苿?dòng)到和它pI相符的pH處。

    IEF-PAGE操作簡單，只要一般電泳設(shè)備就可進(jìn)行，電泳時(shí)間短、分別率高、應(yīng)用范圍廣，可用于分離蛋白質(zhì)及測定pI，也可用于臨床鑒別診斷、農(nóng)業(yè)、食品研究等各種領(lǐng)域。

試劑和器材

1、試劑

    Acr-Bis貯存液：29.1g  Acr，0.9g  Bis，用無離子水溶解后定容至100mL，不溶物過濾去除后置棕色瓶，貯于冰箱。

   等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)蛋白（pH3～10）試劑盒，臨用前稀釋至0.1～0.3mg/mL。

   適合于pH3～pH10范圍的電極溶液：

（1）、陰極電極溶液（1mol/L、NaOH）。稱NaOH（AR）4g，加去離子水使其溶解，冷卻至室溫再定容至100mL。

（2）、陽極電極溶液（1mol/L、H3PI4）。取H3PO4（85%）6.7mL，加去離子水定容至100mL。

固定液：稱取磺基水楊酸3.5g，三氯乙酸10mL，甲醇35mL，加去離子水至100mL。

染色液：稱取考馬斯亮藍(lán)R250、0.1，冰乙酸10mL，甲醇35mL，加去離子水使其*溶解，再定容至100mL，過濾后置棕色瓶保存。

脫色液：取無水乙醇50mL，冰乙酸20mL，加蒸餾水至200mL。

保存液：取無水乙醇25mL，冰乙酸10mL，甘油5mL，加蒸餾水至100mL。

10%過硫酸銨，TEMED，40%兩性電解質(zhì)載體（pH3～10）。

2、材料

    待測已純化的蛋白質(zhì)樣品（脫鹽），濃度0.5mg/mL。

3、器材

    等電聚焦電泳槽，移液管（1，5,10mL），燒杯（25,50,100mL）細(xì)長頭的吸管，微量注射器（10uL或者50uL），漏斗，濾紙，鑷子。

操作方法

1、準(zhǔn)備工作

    配制凝膠前，應(yīng)把玻璃板準(zhǔn)備好。即將兩塊干凈的玻璃板疊放在一起，之間夾上所需凝膠厚度的膠條進(jìn)行密封。然后用文具夾將玻璃板四周固定好。注意夾子作用力點(diǎn)在膠條正中，以防漏膠。

2、配制凝膠

    取Acr-Bis貯備液2.0mL；兩性電解質(zhì)0.5mL；去離子水5.5mL；TEMED  8uL置于小燒杯中混勻，再加入10%過硫酸銨50uL，用磁力攪拌器充分混勻2min。然后用注射器吸凈混合液，排除氣泡，緩緩注入玻璃板的夾隙內(nèi)，注意勿出現(xiàn)氣泡。

3、電泳

（1）、、剝膠板。將膠板取出，揭去上層的玻璃板和膠條，然后用蒸餾水輕輕沖洗一下膠面。

（2）、點(diǎn)樣。用小紙條（0.5cm×0.5cm）蘸上，均勻地點(diǎn)在膠板上，點(diǎn)樣要求整齊、迅速。注意膠板兩邊要留出一定空間。通常把p1在酸性范圍的樣品放在偏堿性的位置（負(fù)極），P1偏酸性的樣品放在偏酸性的位置（正極），標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合樣品放在中間。

（3）、進(jìn)樣。將浸入電極液的濾紙條取出，使其分別平直緊貼在膠面兩端，然后放入電泳槽內(nèi)，注意正負(fù)極相吻合。將電極板正極（電極條浸有H3PO4的一側(cè)）與負(fù)極（電極條浸有NaOH的一側(cè))分別與電泳儀的正、負(fù)極鏈接。接通冷卻水，在室溫下電泳，把電泳儀調(diào)至電壓50V，電流以每板膠不超過17mA為準(zhǔn)，然后開始電泳。進(jìn)樣時(shí)間一般在1.5～2h。

（4）、揭樣紙。待電流降至每板膠3mA以下時(shí)，切斷電源，取出膠板，揭去加樣紙后，將電壓調(diào)至220～320V斷續(xù)電泳。

（5）、加壓。當(dāng)電流降至每板膠3mA以下時(shí)，升高電壓至580V，繼續(xù)電泳1.5h左右。

（6）、電流降至每板3mA以下時(shí)，切斷電源，停止電泳。

4、固定、染色和脫色

    將凝膠板放在培養(yǎng)皿中，加入固定液，浸泡數(shù)小時(shí)后，用脫色液清洗兩次，每次10min，然后加入染色液，室溫下放置15～30min，再用脫色液洗脫數(shù)次，直至譜帶清晰，放入保存液中浸泡10min，可制干板。

5、制作干膠板

（1）、取*浸濕的平整玻璃紙一張，于玻璃板上鋪平，紙與板之間不可有氣泡。

（2）、將凝膠鋪于上述玻璃紙上，對(duì)齊中心位置，使四邊留出距離相等，隨后將膠與紙之間的氣泡輕輕趕跑。然后，把另一張玻璃紙折起蓋在膠面上，并與下層玻璃紙對(duì)齊，膠與兩層玻璃紙之間要避免氣泡，要求光滑平整。

（3）、將凝膠四邊上下兩層玻璃紙貼緊，使膠邊邊緣上*沒有氣泡。然后將各邊的玻璃紙多余部分折向玻璃板反面。

（4）、置于室溫中自然干燥，*干燥后的膠板，手感如觸及玻璃板。這時(shí)，可將膠板揭下，截去邊角多余的紙，即可得一張圖譜清晰的干膠板。

注意事項(xiàng)

（1）、支持介質(zhì)。在IRF-PAGE中，丙烯酰胺純度極為重要，Acr及Bis中如有丙烯酸，則引起聚焦后pH梯度漂移，一般需用重結(jié)晶法進(jìn)一步純化Acr及Bis。zui近，Pharmacia公司推出Amberlite MB-6除去丙烯酸，其效果較再結(jié)晶法更佳。

（2）、兩性電解質(zhì)載體。兩性電解質(zhì)載體是IEF-PAGE中zui關(guān)鍵的試劑，直接影響pH梯度的形成以及蛋白質(zhì)的聚焦。因此，要選用的兩性電解質(zhì)載體，在凝膠中，其終濃度一般為1%～2%。pH梯度的線性依賴于兩性電解質(zhì)的性質(zhì)，選擇哪種pH梯度范圍的兩性電解質(zhì)載體，則與被分離蛋白質(zhì)的pI有關(guān)。

（3）、樣品預(yù)處理與加樣方法。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，鹽離子可干擾pH梯度形成，并使區(qū)帶扭曲。為了防止上述影響，進(jìn)行IEF-PAGE時(shí)，樣品應(yīng)透析或用Sephadex  G-25脫鹽，也可將樣品溶解在水，或是低鹽緩沖液中，使其充分溶解，以免不溶小顆粒引起拖尾。但某些蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)附近，或水溶液及低鹽溶液中，溶解度較低，則可在樣品中加入兩性電解質(zhì)，如加入1%甘氨酸或?qū)?%甘氨酸透析。雖然甘氨酸是兩性電解質(zhì)，但不影響pH梯度的形成，可利用其在溶液中的偶極距作用增加蛋白質(zhì)的溶解性。此外，還可在樣品及凝膠溶液中加入無離子去污劑如Tween 80，Triton  X-100，Nonide P-40等或加入相同濃度的尿素（4mol/L），以免氰酸鹽引起蛋白質(zhì)的氨甲酰化，含有尿素的樣品及凝膠板只能當(dāng)天使用。

     加樣量取決于樣品中蛋白質(zhì)的種類、數(shù)目及檢測方法的靈敏度。如用銀染色，加樣量可減少到1ug。一般樣品濃度以0.5～3mg/mL為宜，zui適加樣體積為10～30uL。如樣品很濃，可直接在凝膠表面加2～5uL；如樣品很稀，可加樣300uL。值得注意的是：對(duì)不穩(wěn)定的樣品可先將凝膠進(jìn)行15～30min預(yù)電泳，使pH梯度形成，然后將樣品放再靠近pI的位置以縮短電泳的時(shí)間，但不要將樣品正好加在pI處和緊靠陽、陰極的膠面上，以免引起蛋白質(zhì)變性造成區(qū)帶扭曲。一般加樣電泳半小時(shí)后，取出加樣濾紙以免引起拖尾現(xiàn)象。

（4）、電功率、時(shí)間等因素。在IEF電泳中，隨著樣品的遷移越接近pI時(shí)，電流則越來越小。為使各成分能更好地分離，要保持一定的電功率，就應(yīng)不斷增加電壓，電壓增高可縮短PH梯度形成，和蛋白質(zhì)分離所需的時(shí)間，但過高的電壓會(huì)使凝膠板局部范圍過熱。因此，在電泳過程中，應(yīng)通冷卻水，水溫以4～10℃為宜，流量5～10L/min。一般寬pH范圍電泳時(shí)間以1.5～2h為宜。