主要用途

細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）活性熒光定量檢測試劑是一種旨在通過熒光探針MCA供體和DAP/DNP受體雙重標(biāo)記的多肽底物PLGLAR，在蛋白酶的水解下，解離抑制基團(tuán)，產(chǎn)生熒光產(chǎn)物，即采用熒光法來測定樣品中酶活性而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品（動物、人體）、部分或*純化酶樣品中基質(zhì)金屬蛋白酶（包括1、2、3、7、8、9、10、12、13、14等）的定量檢測，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，安全可靠。

保存方式

保存底物液（Reagent D）和標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）在-20℃冰箱里；緩沖液（Reagent C）保存在室溫下；其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent D）避免光照，有效保證3月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于標(biāo)準(zhǔn)樣品配制和樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于脫離貼壁細(xì)胞

（微型）臺式離心機(jī)：用于樣品操作

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育

黑色96孔板：用于熒光分析的容器

熒光酶標(biāo)儀：用于熒光分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

一、樣品準(zhǔn)備

 1． 準(zhǔn)備好75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁷細(xì)胞）

2． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：避免使用胰酶消化）

5． 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞

6． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）

7． 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混勻

10． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

11． 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒

12． 置于冰槽里孵育30分鐘

13． 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管

15． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

16． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 測定準(zhǔn)備 

1． 準(zhǔn)備好待測樣品（例如細(xì)胞裂解萃取液或純化酶樣品等），置于冰槽里

2． 設(shè)定好熒光酶標(biāo)儀（溫度為37℃）：激發(fā)波長330nm，散發(fā)波長400nm，間隔5分鐘，讀數(shù)6次（共30分鐘）；增益倍數(shù)100至200

3． 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

4． 準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號管

5． 分別加入xx微升緩沖液（Reagent C）到1至5號管

6． 移取xx微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到1號管，混勻

7． 小心移取xx微升1號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到2號管，混勻

8． 小心移取xx微升2號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到3號管，混勻

9． 小心移取xx微升3號管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到4號管，混勻

10． 將1至5號管放進(jìn)冰槽里備用；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表

三、熒光測定 

1． 在黑色96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品

2． 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到相應(yīng)孔里

3． 分別加入20微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液或待測樣品（20微克純化酶或100微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）

4． 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育10分鐘

5． 分別加入xx微升底物液（Reagent D）

6． 輕輕搖動黑色96孔板

7． 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀檢測：獲得相對熒光讀數(shù)RFU（Relative Fluorescence Unit）

8． 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為相對熒光單位RFU；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)甲氧基多肽濃度（微摩爾/升）

9． 標(biāo)準(zhǔn)樣品實(shí)際熒光讀數(shù)：標(biāo)準(zhǔn)樣品值—背景對照值

10． 待測樣品實(shí)際熒光讀數(shù)：5分鐘熒光讀數(shù)—背景對照熒光讀數(shù)

11． 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)甲氧基多肽濃度（微摩爾/升）

12． 活性計(jì)算：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)甲氧基多肽濃度（微摩爾/升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷ 5（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）＝納摩爾/毫升/分鐘÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝納摩爾/毫克/分鐘