注意：正式測定之前選擇2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

貨號: JSK540

規(guī)格: 50T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存； 試劑一：液體 60mL×1 瓶，4℃保存； 試劑二：液體 100μL×3 瓶，4℃保存。

產(chǎn)品說明：

CAT(EC 1.11.1.6)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是最主要的 H₂O₂ 清除酶，在活性氧清除系統(tǒng)中具有重要作用。

H₂O₂ 在 240nm 下有特征吸收峰，CAT 能夠分解 H₂O₂，使反應(yīng)溶液 240nm 下的吸光度隨反應(yīng)時間而下降，根據(jù)吸光度的變化率可計算出 CAT 活性。

試驗中所需的儀器和試劑：

紫外分光光度計、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水

操作步驟：

一、粗酶液提?。?/span>

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（ml）為 500-1000:1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率 20%或 200w，超聲 3 秒，間隔 10 秒。重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10 分鐘，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（ml）為 1：5-10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10 分鐘，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。二、CAT 測定操作

1、 分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 240nm 處，蒸餾水調(diào)零。

2、 CAT 檢測工作液的配置：用時在每瓶試劑二（100μL）中加入 20ml 試劑一，充分混勻，作為工作液；用不完的試劑 4℃保存一周。

3、 測定前將 CAT 檢測工作液 37℃（哺乳動物）或 25℃（其他物種）水浴 10min。

4、 取 1mLCAT 檢測工作液于 1mL 石英比色皿中，再加入 35μL 樣本，混勻 5s；室溫下立即測定 240nm

下的初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2。計算ΔA=A1-A2

三、CAT 活性計算：

1、 血清（漿）CAT 活力的計算：

單位的定義：每毫升血清（漿）在反應(yīng)體系中每分鐘催化 1nmol H₂O₂ 降解定義為一個酶活力單位。

CAT（U/mL）＝﹝ΔA×V 反總÷（ε×d）×109﹞÷V 樣÷T=678×ΔA 2、 組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 CAT 活力計算：

a. 按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化 1nmol H₂O₂ 降解定義為一個酶活力單位。

CAT（U/ mg prot）＝﹝ΔA×V 反總÷（ε×d）×109﹞÷（V 樣×Cpr）÷T=678×ΔA÷Cpr

b. 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每 g 組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化 1nmol H₂O₂ 降解定義為一個酶活力單位。

CAT（U/g 鮮重）＝﹝ΔA×V 反總÷（ε×d）×109﹞÷（W×V 樣÷V 樣總）÷T=678×ΔA÷W 3、 按細(xì)菌或細(xì)胞中 CAT 活力計算：

單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞在每分鐘反應(yīng)體系中每分鐘催化 1nmol H₂O₂ 降解定義為一個酶活力單位。

CAT（U/104 cell）＝﹝ΔA×V 反總÷（ε×d）×109﹞÷（500×V 樣÷V 樣總）÷T=1.356×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1.035×10-3L；ε: H₂O₂ 摩爾吸光系數(shù)，4.36×104L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.035ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應(yīng)時間，1min。W，樣本質(zhì)量，g；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/ml；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬。