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1.前言

循環(huán)游離核酸(circulating cell-free nucleic acids)是指存在于人體循環(huán)系統(tǒng)中，游離于細(xì)胞外的微量內(nèi)源性或外源性核酸片段，包括核DNA、線粒體DNA(mitochondrial DNA，mitDNA)、病毒DNA、信使RNA(messenger RNA，mRNA)及微小RNA(microRNA，miRNA)等。1948年，Mandel等^［1］*發(fā)現(xiàn)了血液循環(huán)中游離DNA的存在。隨后，循環(huán)游離核酸在病理狀態(tài)下的特異性變化引起了廣泛關(guān)注。雖然這一發(fā)現(xiàn)十分重大，但當(dāng)時并未引起人們的廣泛關(guān)注，并且在此后的很長一段時間里，人們也僅局限于研究游離 DNA 與人類自身免疫病之間的關(guān)系。1975 年，Steinman 在健康人的血漿中也發(fā)現(xiàn)有游離形式的核酸存在，這提示我們這種核酸的出現(xiàn)屬于病理學(xué)事件，而非病因?qū)W事件，但健康人血漿中游離 DNA 的量要顯著低于患有一定疾病的人。1977年，Leon等^［2］發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血清中的游離DNA水平較健康人群明顯升高，并與腫瘤的進(jìn)展與預(yù)后相關(guān)。1997年，人們發(fā)現(xiàn)在孕婦血漿中含有游離形式的胎兒源的 DNA，這使得血漿游離核酸的研究在胎兒出生前診斷方面的應(yīng)用也有了快速的發(fā)展。1989年，Stroun等^［3］發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血液中的游離核酸含有與腫瘤細(xì)胞相同的基因突變?，F(xiàn)如今，游離核酸與腫瘤、妊娠相關(guān)性疾病、自身免疫病、移植排斥反應(yīng)、創(chuàng)傷、急救醫(yī)學(xué)等有著密切關(guān)系，其檢測對疾病的早期診斷、分期、監(jiān)測、預(yù)后判斷等有重要意義。

鑒于游離核酸的重要檢測意義，游離核酸的保存條件則直接決定了檢測結(jié)果的可靠性。為確保游離核酸標(biāo)本檢測的準(zhǔn)確性，本文采用了市面上常用的不同品牌游離核酸保存管，就保存效果進(jìn)行了比較。

2 材料與方法
2. 1 材料

2.1.1保存管及分組

（1）E組：普通抗凝采血管（主要成分EDTA·2Na）；

（2）S組：Cell-Free DNA BCT（品牌：S公司，REF.2***52）；

（3）B組：Cell-Free DNA Storage Tube 10mL(品牌：Bioteke，REF. ST2001)；

（4）K組：Cell-Free DNA Storage Tube 10mL（品牌：K公司，Cat. CW***6S）。

 

2.1.2血液樣本

健康人血10ml。

2.1.3 試劑及設(shè)備

（1）Premix EX Taq （TaKaRa,Cat.RR390A）；

（2）探針及引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；

（3）Qubit dsDNA HS Assay Kit（Invitrogen by Thermo Fisher Scientific）；

（4）Beta-actin質(zhì)粒由上海捷瑞生物工程有限公司合成；

（5）BioRad-CFX96(BIO-RAD, Foster city, California，USA），Qubit 2.0 Fluorometer (Life Technologies，USA)，Mili-Q Advantage A10，SHZ-82A恒溫振蕩器（常州醫(yī)療器件廠）。

2.2方法

2.2.1血液樣本采集

采用標(biāo)準(zhǔn)靜脈穿刺采集年齡22-40歲健康人血10ml，各組年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），分別裝于采血管及保存管。

2.2.2血漿分離方法

輕柔上下顛倒混勻10次，800×g，20min，轉(zhuǎn)移上層血漿至1.5ml離心管；16,000×g，室溫，10min，轉(zhuǎn)移上層血漿至1.5ml離心管凍存-80℃?zhèn)溆?。提取游離核酸前，室溫解凍，16,000×g，5min，吸取上層血漿，進(jìn)行游離核酸提取。

2.2.3 游離核酸提取方法

     根據(jù)QIAamp Circulating Nucleic Acid Handbook 試劑盒操作說明操作。

2.2.4 Qubit熒光計定量血漿游離DNA的濃度

采用Qubit 2.0熒光計定量血漿游離DNA的濃度。

2.2.5 Beta-actin拷貝數(shù)的檢測

Beta-actin 10倍梯度稀釋10⁷-10¹，引物分別分actin-F1，actin-R1，探針為probe actin，引物及探針工作濃度為5 uM，20ul熒光定量體系引物加入量為各1ul。

擴(kuò)增程序為50°C、5min，95°C、10min，循環(huán)50次， 95°C、20s，65°C、20s，72°C、 10min，結(jié)束。

 擴(kuò)增程序試劑組成：

Reagent	體積（ul）
Takara Premix	10
Primer F	1
Primer R	1
Probe	1
模板	1
ddH2O	補足20ul

3 結(jié)果

3.1不同天數(shù)下（25°C）游離核酸保存效果的對比

    分別用3種不同的保存管（E、S及B）采集血液10ml，顛倒混勻15次后立即等分4份至無抗凝劑無促凝劑的玻璃采血管中，保存條件為25°C。分別于保存第0、3、7、14天時分離血漿，提取游離核酸。

圖 1不同保存天數(shù)下血液保存現(xiàn)象

 圖1 顯示：保存第7天和第14天，E組出現(xiàn)明顯的溶血現(xiàn)象，并隨時間的延長更加嚴(yán)重；S品牌產(chǎn)品保存的血液第7天略微有溶血現(xiàn)象，第14天時，溶血嚴(yán)重。相比之下，B品牌產(chǎn)品效果較佳。

 

圖 2  Qubit 檢測不同保存天數(shù)下每毫升血液cf-DNA濃度（ng/ml）

圖2 顯示：25°C條件下，E產(chǎn)品在第0天時，基因組基本無釋放；第3、7、14天的核酸量隨時間延長，基因組釋放量增加明顯；第14天的核酸檢測量是第0天的至少2500倍。 B產(chǎn)品的保存效果在14天之內(nèi)，基本能夠抑制基因組的釋放；第14天的檢測結(jié)果為第0天的1.77倍。S品牌產(chǎn)品7天之內(nèi)，能夠保持cfDNA穩(wěn)定，基本無基因組釋放；但第14天檢測量劇增，是第0天的2200倍。

 

圖3 不同保存天數(shù)下每毫升血液Beta-actin拷貝數(shù)

圖3 顯示：Beta-actin定量結(jié)果趨勢與Qubit結(jié)果基本一致，室溫25°C保存3天，3種保存管的差異不顯著；保存第7天時，E與B組間的P Value<0.01，差異極顯著，B與S組 0.01<P value<0.05，差異具有顯著性；保存第14天時，B與S組P value<0.01，差異極顯著。

 

圖4 不同保存天數(shù)下每毫升血液cf-DNA濃度（ng/ml）

圖4Qubit結(jié)果顯示：三種保存管7天內(nèi)保存效果無明顯差異，14天時，K組與S組保存管均出現(xiàn)明顯的上升，分別是第0天的15.27倍和10.21倍，21天時，上升較為明顯，分別是第0天的22.46倍和13.84倍。B組保護(hù)劑保存的血液在第0、3、7、14、21、28天檢測時，每毫升血液cf-DNA濃度均無明顯的上升。

 

圖5 不同保存天數(shù)下每毫升血液Beta-actin拷貝數(shù)

圖5Beta-actin定量結(jié)果與圖4基本一致。B2組保護(hù)劑保存的血液在第0、3、7、14、21、28天檢測時，每毫升血液Beta-actin拷貝數(shù)均無明顯的上升。

 3.2不同天數(shù)下（4°C）游離核酸保存效果的對比

 

圖6 不同保存天數(shù)下每毫升血液cf-DNA濃度（ng/ml）

圖6Qubit結(jié)果顯示：在4°C情況下，三種保存管0-14天的每毫升血液cf-DNA濃度并無明顯的差異。

 

圖7 不同保存天數(shù)下每毫升血液Beta-actin拷貝數(shù)

圖7Beta-actin結(jié)果顯示：在4°C情況下，三種保存管0-14天的每毫升血液Beta-actin拷貝數(shù)并無明顯的差異。

3.3不同天數(shù)下（37°C）游離核酸保存效果的對比

 

 

圖8 不同保存天數(shù)下每毫升血液cf-DNA濃度（ng/ml）

圖8Qubit結(jié)果顯示：在37°C情況下，三種保存管0-14天的每毫升血液cf-DNA濃度并無明顯的差異。

 

圖9Beta-actin結(jié)果顯示：在37°C情況下，三種保存管0-14天的每毫升血液Beta-actin拷貝數(shù)并無明顯的差異。

3.4運輸環(huán)境（25°C）對游離核酸保存效果的影響

考慮到保存管有可能應(yīng)用于樣品的長途或短途運輸，因此需用搖床模擬運輸環(huán)境對保護(hù)劑抑制細(xì)胞破裂的影響。S組、K組及B組分別采集血液一份，搖床設(shè)置180rpm，25°C，分別在0、3、7、14天檢測核酸濃度和beta-actin拷貝量。

 

圖10 不同保存天數(shù)下每毫升血液cf-DNA濃度（ng/ml）

圖10Qubit結(jié)果顯示：在25°C模擬震蕩情況下，三種保存管0-14天的每毫升血液cf-DNA濃度并無明顯的差異。

 

圖11不同保存天數(shù)下每毫升血液Beta-actin拷貝數(shù)

圖11Beta-actin結(jié)果顯示：在25°C模擬震蕩情況下，三種保存管0-14天的每毫升血液Beta-actin拷貝數(shù)并無明顯的差異。

4.討論

（1）從每毫升血液Beta-actin拷貝數(shù)及每毫升血液cf-DNA濃度兩個方面來驗證cf-DNA完整性，已在多篇文獻(xiàn)中^[4][5]得到驗證。

（2）室溫25°C下，保存3天時，3種保存管的差異不顯著；保存第7天時，E與B組間的差異極顯著，B與S組差異具有顯著性；保存第14天時，B與S組P value<0.01，差異極顯著。在室溫25°C下，B組較S組及E組，保存時間較長，效果較佳。

（3）室溫25°C下，三種保存管7天內(nèi)保存效果無明顯差異，14天時，K組與S組保存管均出現(xiàn)明顯的上升，，21天時，上升相對明顯。B組保護(hù)劑保存的血液在第0、3、7、14、21、28天檢測時，每毫升血液cf-DNA濃度均無明顯的上升。在室溫25°C下，B組較S組及K組，保存時間較長，效果較佳。

（4）在4°C情況下，三種保存管0-14天的每毫升血液Beta-actin拷貝數(shù)及每毫升血液cf-DNA濃度并無明顯的差異。在4°C下，B組、S組及K組，保存效果無明顯差異。

（5）在37°C情況下，三種保存管0-14天的每毫升血液Beta-actin拷貝數(shù)及每毫升血液cf-DNA濃度并無明顯的差異。在37°C下，B組、S組及K組，保存效果無明顯差異。

（6）在25°C模擬震蕩情況下，三種保存管0-14天的每毫升血液Beta-actin拷貝數(shù)及每毫升血液cf-DNA濃度并無明顯的差異。在25°C模擬震蕩情況下，B組、S組及K組，保存效果無明顯差異。

5.參考文獻(xiàn)

[1]MANDEL P, MÉTAIS P. Les acides nucléiques du plasma sanguin chez l’homme ［J］. C R Acad Sci Paris, 1948,142: 241-243.

[2]LEON S A, SHAPIRO B, SKLAROFF D M, et al. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy ［J］.Cancer Res, 1977, 37(3): 646-750.

[3]STROUN M, ANKER P, MAURICE P, et al. Neoplastic characteristics of the DNA found in the plasma of cancer patients［J］. Oncology, 1989, 46(5): 318-322.

[4]Norton S E, Lechner J M, Williams T, et al. A stabilizing reagent prevents cell-free DNA contamination by cellular DNA in plasma during blood sample storage and shipping as determined by digital PCR[J]. Clinical Biochemistry, 2013, 46(15):1561-5.

[5] Ryan W L, Fernando R M, Das K. BLOOD COLLECTION DEVICE FOR STABILIZING CELL-FREE PLASMA DNA:, WO 2013123030 A3[P]. 2013.