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非洲豬瘟病毒DNA檢測方案

 

 

1.常見樣本類型：

分泌物、血液、脾臟、扁桃體、腎臟和淋巴結(jié)等樣本中的非洲豬瘟。

2.. 樣品預(yù)處理方式（樣本處理區(qū)）

2.1 樣本前處理

2.1.1組織樣品：每份組織分別從 3 個(gè)不同的位置稱取樣品約 1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取

0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心2min，取上清液 200μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；病樣組織直接上機(jī)提取也有實(shí)驗(yàn)室在用（江蘇泰州農(nóng)委）

2.1.2全血樣本：取全血離心后的上清（血清） 200μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。

相關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)備：動(dòng)物組織研磨儀、手持式電動(dòng)組織研磨儀

 

 

根據(jù)樣本數(shù)量多少可用高通量組織破碎儀或者手持式組織研磨儀破碎組織樣本，之后用離心機(jī)將樣本離心分層，取上清液。

2.2樣本保存和運(yùn)輸

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個(gè)月，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 藍(lán)冰和干冰運(yùn)輸，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

 

2.3 DNA 提取

對上述處理好的標(biāo)本加入到預(yù)裝好提取試劑的96深孔板中，將加好樣本的耗材放置到96全自動(dòng)核酸提取儀中提取核酸。

 

96全自動(dòng)核酸提取儀用于病毒核酸的提取，配套提取試劑可以以散裝形式提供，也可以以預(yù)裝的形式提供，96高通量移液工作站可以用于散裝試劑的分裝。

 

3. 試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，將上游引物、下游引物、熒光定量探針、酶液預(yù)混好，將混合好反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中。舉例如下：

 

4. 加樣（樣本處理區(qū)）

將提取的 DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取一定量，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

                                                              

 

5. PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

5.1 將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

5.2 設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 20μL；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

5.3 相關(guān)設(shè)備：

BTK-6 熒光PCR儀、BTK-10 超快速熒光PCR儀、ABI7500、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

6. 結(jié)果分析判定

按照非洲豬瘟核酸檢測試劑盒指導(dǎo)進(jìn)行判讀。

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相關(guān)設(shè)備及試劑

產(chǎn)品編號	產(chǎn)品名稱	備注
AU1001-96	96全自動(dòng)核酸提取儀
AU1001	32全自動(dòng)核酸提取儀
AU1096A	96高通量移液工作站
AU52011-96	磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒(預(yù)裝)	96次
CK2160	臺式高速離心機(jī)	配3號角轉(zhuǎn)子：  24×1.5/2.2ml
PR7901	DNA病毒熒光PCR反應(yīng)液	50次
PR7911	非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測試劑盒	48次
BTK-6	熒光定量PCR儀