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本文轉載自“藥明康德”。

“It is very easy to answer many fundamental biological questions; you just look at the thing!”——1965年諾貝爾物理學獎得主理查德•費曼教授

正如費曼教授所言，結構生物學的核心正在于“看清事物”。只要分辨率足夠高，能看清諸多生物分子在原子層面上的細節(jié)，它們的工作方式也就不言自明了。也正是由于這個原因，從歷*看，結構生物學領域做出的發(fā)現(xiàn)，帶來了許多生物學突破，也推動了不少創(chuàng)新療法的開發(fā)。

在諸多讓人類“高清看世界”的技術里，X射線晶體學是生物學家們使用多的技術之一，也讓人類獲得了大量生物大分子的結構。但這種方法需要事先獲取這種大分子的晶體。盡管許多蛋白質和一些穩(wěn)定的復合體能產生質量足夠高的晶體，但對于膜蛋白或動態(tài)的復合體來說，獲取晶體就不是那么容易。

我們能不依賴于晶體獲取，直接“觀察”這些大分子嗎？自上世紀70年代起，許多嘗試使用基于電子顯微鏡的方法來解決這個問題。初，它的分辨率并不盡如人意。但經歷了40年的發(fā)展，冷凍電鏡技術取得了突破，一躍成為了結構生物學的主流工具之一，與X射線晶體學形成了的互補。

單粒子冷凍電鏡的誕生

事實上，想通過電子顯微鏡來看清生物大分子，并不是一件容易的事。首先，和通常的照片一樣，電子顯微鏡獲取的圖像是二維的，而生物大分子的結構是三維的。這一問題通過一個巧妙的方法得到了解決：對于同一個生物大分子，我們可以從不同的角度獲取它的二維圖片。將這些圖片整合到一起，就可以重建出三維的結構。

而電子顯微鏡遇到的另一個問題，曾一度被認為是它的致命硬傷——為了達到*效果，電子束必須處于真空環(huán)境之中。于是，這些樣本也必須位于同樣的真空里。對于生物大分子來說，這就造成了嚴重問題：真空導致的脫水會對樣本的結構完整性帶來破壞性的影響。從機制上看，用電子顯微鏡來觀察生物大分子就好像是個不可能完成的任務。

▲將樣品“凍起來”，可以保留生物大分子的完整性（圖片來源：By Vossman ）

1974年發(fā)表在《科學》雜志上的一項研究彰顯了人類的智慧。在加州大學伯克利分校，還是在讀研究生的Kenneth Taylor與其導師Robert Glaeser教授表明，生物大分子的結構完整性，可以通過將它們“凍起來”而得到保留。這一發(fā)現(xiàn)在上世紀80年代被Jacques Dubochet教授及其同事們發(fā)揚光大，基于這一發(fā)現(xiàn)開發(fā)的樣本制備技術時至今日都沒有出現(xiàn)很大的改動。

研究人員們也指出了電子顯微鏡的第三個問題——高能電子束帶來的輻射可能會對生物學樣本造成破壞，從而限制了電子束的強度。而電子束較弱的結果，便是過低的信噪比。Richard Henderson教授等人提出的一個解決方案，將晶體學中的技術應用到電子顯微鏡成像過程中。利用電子晶體學（electron crystallography）技術，人們取得了一系列進展，解析出的結構分辨率高達1.9 Å。

▲三位在冷凍電鏡領域做出開拓性貢獻的科學家共享了2017年的諾貝爾化學獎（圖片來源：The Nobel Prize in Chemistry 2017. NobelPrize.org. Nobel Media AB 2018. Wed. 12 Sep 2018. ）

而Joachim Frank教授則希望能夠規(guī)避結晶這一手段來確認蛋白質的結構。他提出，通過對同一種蛋白粒子進行大量的獨立拍攝，再通過計算機來整合這些圖片，有望能獲得高清的結構。這一創(chuàng)新的想法與樣本的冷凍制備相結合，成為了如今我們熟悉的“單粒子冷凍電鏡”（single-particle cryo-EM）。Frank教授、Dubochet教授、以及Henderson教授三人也共享了2017年的諾貝爾化學獎。

結構生物學的新紀元

單粒子冷凍電鏡技術為結構生物學帶來了新的突破，使其邁入了新紀元。原本難以結晶的目標，其結構也能展現(xiàn)在人類面前，膜蛋白就是這樣的例子。在這篇綜述中，加州大學舊金山分校的程yi凡教授介紹了冷凍電鏡如何協(xié)助我們獲得了瞬態(tài)受體電位（TRP）離子通道的結構。

▲本篇《科學》綜述的作者程yi凡教授

TRP通道超家族分為7大類，在人類中總共有27個成員，每一個通道都有著特定的生理功能，其中一些也有望成為治療人類疾病的靶點。但除了這些通道里的少數(shù)小型結構域外，人們對這些通道的結晶嘗試往往以失敗而告終，這也限制了對這些靶點的進一步開發(fā)。

2013年，這一困境迎來了終結。當年，《自然》上的兩篇論文利用單粒子冷凍電鏡技術，獲取了TRPV1離子通道位于三種不同狀態(tài)下的結構，讓我們更好地理解了其“感受熱量，激活疼痛通路”的作用。TRPV1結構的獲得再次強調了冷凍電鏡的巨大潛力——當“獲取晶體”這一限速步驟被移除后，我們能夠以極快的速度獲得膜蛋白的原子結構。據(jù)統(tǒng)計，在不到5年的時間里，每一類TRP通道，均有至少1個成員的結構得到了解析。

對于大型的動態(tài)復合體來說，冷凍電鏡更是讓原本無法通過結晶獲取的結構呈現(xiàn)在了人類面前，剪接體就是的例子。過去，人們要么只能獲得其中片段的原子結構，要么只能獲得分辨率較低的整體結構。而在單粒子冷凍電鏡的協(xié)助下，在幾年里，我們就獲得了剪接體在不同工作狀態(tài)下的結構，從而拼接出了它工作的完整畫面。這在過去是難以想象的。

冷凍電鏡領域的快速發(fā)展，也吸引了諸多醫(yī)藥企業(yè)的關注。它們期望能夠應用這一技術，優(yōu)化藥物的發(fā)現(xiàn)過程。

醫(yī)藥企業(yè)的嘗試

在去年11月的一篇《Nature Reviews Drug Discovery》綜述中，作者Mark Peplow博士為我們盤點了藥企在冷凍電鏡領域的布局與嘗試。

對于大型藥企來說，在公司內部的建立冷凍電鏡能力是其布局的主要方向——基因泰克在組建內部的冷凍電鏡團隊；輝瑞斥資500萬英鎊使用新款的冷凍電鏡；諾華通過與Friedrich Miescher研究所的合作也構建了自己的冷凍電鏡中心。諾華生物醫(yī)藥研究所（NIBR）的蛋白質科學負責人Christian Wiesmann說，他們的冷凍電鏡中心已經初見成效。利用冷凍電鏡技術，他們獲得了一款蛋白與一種小分子結合時的結構，這能指導藥物化學的開發(fā)。

對于另一些藥企或生物技術公司來說，他們決定組成聯(lián)盟，共同使用冷凍電鏡工具。這一方面是出于成本的考量，但更重要的是，這種聯(lián)盟能夠促進經驗的交流。在英國，劍橋醫(yī)藥冷凍電鏡聯(lián)盟（Cambridge Pharmaceutical Cryo-EM Consortium）就是這樣的例子——在5家藥企的合作下，這一聯(lián)盟獲得了超過300萬英鎊的資金，于2016年正式啟動。

去年5月，該聯(lián)盟的成員之一阿斯利康發(fā)表了一篇論文，揭示了人類突變ATM蛋白的結構。ATM蛋白是一類大型激酶，與DNA的修復有關，在癌癥發(fā)病中有潛在的作用。而研究人員們獲得的結構，其分辨率為4.4Å，足以看清其兩個構象，其中一個處于“打開”狀態(tài)，可以結合底物；另一個則處于“關閉”狀態(tài)。這些發(fā)現(xiàn)帶來了該蛋白的高清結構，也表明它作為分子開關的重要作用。

該聯(lián)盟的另一個成員Heptares則在探索GPCR的結構。作為一類膜蛋白，它們通常會因為分離過程而失去正常的結構與活性，因此難以通過常規(guī)的結晶手段制備樣本。但冷凍電鏡技術則沒有這樣的困擾。目前，我們獲得的GPCR結構已能讓我們看清它們與大型多肽相結合時的結構。它們與小分子結合時的高清結構，會是研究人員們未來的研究方向。

冷凍電鏡的未來

冷凍電鏡領域在過去40年里發(fā)生了重大的改變，而這一技術還有不少可以提高的空間。其中的一大關鍵在于進一步提高分辨率，達到2Å左右，另一大關鍵在于提高使用的效率。如果我們能夠快速獲得大批樣品的高清結構，無疑將加速這項革命性技術在醫(yī)藥領域的應用。

此外，硬件與軟件的升級，也將提升冷凍電鏡的能力。更好的光學系統(tǒng)、更好的檢測器、更好的算法軟件，都能讓冷凍電鏡在現(xiàn)有的基礎上如虎添翼。正如一些業(yè)內資深人士指出的那樣，要實現(xiàn)這樣的功能迭代，讓冷凍電鏡成為新藥發(fā)現(xiàn)的常規(guī)工具，或許還需要5到10年的時間。但對于諸多醫(yī)藥與生物技術公司而言，目前或許是將這一工具整合至研發(fā)系統(tǒng)中的*時機。

本文題圖來自Pixabay

參考資料：

1）Y Cheng (2018), Single-particle cryo-EM—How did it get here and where will it go, Science

2）M Peplow (2017), Cryo-electron microscopy makes waves in pharma labs, Nature Reviews Drug Discovery