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距離作為基因組編輯工具僅僅5年，CRISPR幾乎就成為了*的技術(shù)。從一開始作為細(xì)菌切除入侵病毒DNA的方式，到現(xiàn)在，CRISPR已經(jīng)引發(fā)了關(guān)于動物模型、高通量篩選、轉(zhuǎn)基因生物和基因治療的一系列討論。

所有的一切都在以令人震撼的速度增長。誠然，CRISPR并非*，但它的優(yōu)點太多，涉及到其可編程并適用于無數(shù)生物、細(xì)胞類型和眾多研究。截止2018年，已經(jīng)發(fā)布了超過2500篇CRISPR的論文?？梢哉fCRISPR充滿無限的可能，這也許就是它具有讓人難以抵抗的魅力所在。

基于此，越來越多的科研人員需要操作CRISPR實驗。然而，盡管源自化膿鏈球菌（SpCas9）的個且常用的CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有顯著的特異性，但除了理想的基因剪切和復(fù)制之外，已觀察到不同程度的脫靶效應(yīng)（OTE）。

這未免讓研究者感到無所適從，由此，如何避免脫靶效應(yīng)成為了一個重要議題，以下是一些CRISPR實驗設(shè)計的策略，助你實現(xiàn)脫靶效應(yīng)小化。

選擇合適的靶基因和宿主細(xì)胞

在規(guī)劃基因組編輯實驗時，要問的個也許是基本的問題是目的基因是否適合預(yù)期的基因編輯操作（即刪除、插入或突變）以及特定的細(xì)胞環(huán)境（細(xì)胞類型和細(xì)胞系等）。

丨靶基因的選擇

首先，確定目標(biāo)目的基因是否在宿主細(xì)胞中表達以及它是否對細(xì)胞活力是必需的。雖然已經(jīng)確定了一組“細(xì)胞必需基因”，但有些基因依賴于背景，因此目的基因在特定細(xì)胞系中的必需性可能仍需要進一步確定。

其中一個方法是根據(jù)siRNA敲低實驗的信息，但在某些情況下，細(xì)胞可能會在必需蛋白質(zhì)水平降低的情況下也能存活；此外，小鼠基因敲除（KO）數(shù)據(jù)的表型讀數(shù)的也可以檢查目的基因的必需性。

然而，通常很難區(qū)分生物體發(fā)育和細(xì)胞存活本身所需基因，一個物種中基因的必需性可能也無法轉(zhuǎn)化為另一個物種的必需性。一些免費的在線工具應(yīng)運而生，有助于研究者進行相關(guān)的分析。

例如，來自華中科技大學(xué)、第四軍醫(yī)大學(xué)和同濟大學(xué)等機構(gòu)的研究人員建立了一個在線分析細(xì)胞重要性的OGEE™數(shù)據(jù)庫。

OGEE™分析界面截圖（圖片來源：Nucleic Acids Research）

丨細(xì)胞的選擇

對細(xì)胞（原代細(xì)胞、hPSC、iPSC或細(xì)胞系）信息的了解將有助于確定特定研究的適當(dāng)實驗策略，例如具體操作細(xì)胞與研究疾病的生理相關(guān)性（組織起源和/或分化狀態(tài)）。

對于某些多核的細(xì)胞類型如骨骼肌細(xì)胞和破骨細(xì)胞，和攜帶染色體異常（包括缺失，重復(fù)或易位）的許多癌細(xì)胞、hPSCs / hESCs /iPSC以及永生化細(xì)胞系，使所有等位基因?qū)崿F(xiàn)有效突變在技術(shù)上具有一定的挑戰(zhàn)性。

另外，在設(shè)計實驗方法時，細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性是需要考慮的重要因素。由于自發(fā)突變和其他基因組影響，特定細(xì)胞系的基因組序列不一定與給定基因的公開參考序列相同。因此，應(yīng)當(dāng)跨越目的基因區(qū)域進行測序以鑒定可能具有干擾gRNA結(jié)合或CRISPR結(jié)果的序列偏差。

鑒于DNA損傷修復(fù)的缺陷是許多形式的人類癌癥的基礎(chǔ)，源自此類癌癥患者的細(xì)胞系將積累更多突變并具有更低的基因組穩(wěn)定性。例如，長期以來報道來源于患有惡性人淋巴細(xì)胞個體的細(xì)胞系具有比來自正常個體的細(xì)胞系更高的突變頻率；與來自健康供體的細(xì)胞相比，來自患有范可尼貧血和共濟失調(diào)-毛細(xì)血管擴張的患者的B淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞系的突變率分別為30倍和4倍，已知這兩種疾病都是由涉及DNA損傷修復(fù)的基因突變引起的。

選擇合適的宿主細(xì)胞系時要考慮的另一個重要方面是它的細(xì)胞克隆。雖然許多細(xì)胞系初來源于純種群（即克隆細(xì)胞），但自發(fā)突變以及表觀遺傳變化可能隨著培養(yǎng)過程的細(xì)胞傳代而積累。因此，較低的傳代細(xì)胞總是優(yōu)于培養(yǎng)較長時間的細(xì)胞。

根據(jù)GSK研發(fā)人員的經(jīng)驗，陣列比較基因組雜交（aCGH）加上SNP基因組分析是一種簡單快捷的確定細(xì)胞是否適合用作研究對象的方法。aCGH檢測染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)量的改變，而SNP分析允許檢測多倍性、雜合性缺失等。當(dāng)組合時，這些技術(shù)提供關(guān)于細(xì)胞系同源性和染色體重復(fù)/缺失的信息，因此提供關(guān)于位于特定區(qū)段基因的等位基因拷貝數(shù)的信息。此外，還可以對研究中的細(xì)胞系進行其他類型的分析，例如STR、FISH和核型分析。

小化CRISPR脫靶效應(yīng)的策略

丨適當(dāng)?shù)膅RNA設(shè)計

正確選擇用于將Cas9核酸酶導(dǎo)向靶基因的指導(dǎo)RNA（gRNA）是在CRISPR基因組編輯中減少OTE的基本步驟之一。

有許多不同的軟件工具可用于gRNA的設(shè)計，原先大多數(shù)程序基于靶DNA選擇性對gRNA進行排序以對CRISPR/Cas9的脫靶效應(yīng)進行預(yù)測，但許多較新的程序還包括考慮其他因素的算法，例如目標(biāo)切割效率、PAM序列等。

目前，可用的gRNA設(shè)計工具包括但不限于：

• DeepCrispr

• Elevation

• Benchling

• CRISPRscan

• CHOPCHOP

• GuideScan

gRNA設(shè)計在線

此外，還有支持CRSIPRi/CRISPRa gRNA設(shè)計的軟件程序

對于研究者，這么多工具可供選擇的同時，可能也會造成選擇困難。但通過2種或3種不同的工具，然后選擇在每種工具中得分始終較高的gRNA可能是有益的。還有一種選擇是，Addgene公司開發(fā)的CRISPR Software Matchmaker，它可幫助科學(xué)家選擇適合其項目需求的軟件

（圖片來源：Addgene）

丨核酸酶的選擇

核酸酶Cas9能影響切割靶基因的效率和度，是限制CRISPR發(fā)揮巨大潛力的主要問題之一，為此科學(xué)家設(shè)計出了SpCas9的一系列變體。

值得注意是SpCas9-HF1、eSpCas9（1.1）和隨后設(shè)計的超變體HypaCas9。這些高保真的SpCas9核酸酶變體，尤其是HypaCas9，在研究中表現(xiàn)出來顯著減少的OTE，同時保持與原始版本SpCas9相當(dāng)?shù)木庉嬓?。類似地，另一種SpCas9變體“Alt-R S.p. HiFi Cas9”，源自易錯PCR誘變的功能篩選，據(jù)稱具有顯著降低的OTE，同時保持了目標(biāo)效率。

此外，科學(xué)家還通過其它策略實現(xiàn)了OTE的降低，包括使用配對的gRNA將切口酶Cas9或dCas9-FokI融合蛋白引導(dǎo)至靶向位點。每種方法都依賴于通過一對gRNA識別兩個位置緊密的序列以切割兩條DNA鏈，因此在非靶位點編輯的可能性要低得多。

為了突破PAM序列的限制，其它研究人員使用分子進化設(shè)計了一系列的SpCas9的工程化變體，包括xCas9、SaCas9、KKH saCas9等。據(jù)報道，這些工程化變體除了具有增加的靶點選擇范圍外，還保持高靶向效率和特異性。

核酸酶的選擇（圖片來源：Journal of Biotechnology）

丨限制核酸酶的暴露時間

CRISPR核酸酶在宿主細(xì)胞內(nèi)保持活性的時間長短是導(dǎo)致OTE的另一個重要因素。Cas9和gRNA的不同表達水平和持續(xù)時間具體取決于所用的遞送方法。

在許多情況下，穩(wěn)定且組成型表達Cas9的細(xì)胞系已用于CRISPR實驗，雖然Cas9的這種強烈和持續(xù)的表達提高了靶基因編輯的效率，但是可能同時增加了OTE，因為Cas9核酸酶的持續(xù)和高水平表達促進了gRNA和靶標(biāo)錯配的耐受性。

當(dāng)慢病毒（LV）用于產(chǎn)生表達Cas9的穩(wěn)定細(xì)胞系時，使用較高感染復(fù)數(shù)（MOI）將導(dǎo)致更高水平的Cas9表達，但同時也導(dǎo)致更高水平的不期望的病毒整合事件。為了減輕這種影響，Ortinski及其同事設(shè)計了一種用于遞送Cas9和gRNA基因的整合酶缺陷型慢病毒載體，這促使OTE水平顯著降低，同時保持了相當(dāng)?shù)倪f送和靶向編輯效率。

除此之外，許多其他方法也可以減少Cas9暴露的持續(xù)時間或水平。例如：使用細(xì)胞滲透性化合物激活的Cas9融合體，從而通過添加細(xì)胞滲透性化合物來穩(wěn)定CRISPR基因組編輯并且減少OTE；Cas9活性也可以通過使用其天然蛋白質(zhì)抑制劑來調(diào)節(jié)，如衍生自單核細(xì)胞增生李斯特菌前體的AcrIIA4。

在質(zhì)?；虿《颈磉_構(gòu)建體中，通過Cas9/gRNA核糖核蛋白（RNP）復(fù)合物將CRISPR核酸酶遞送到宿主細(xì)胞中具有顯著的優(yōu)勢。據(jù)報道，除了與轉(zhuǎn)染DNA或病毒構(gòu)建體相關(guān)的細(xì)胞毒性降低，易于調(diào)節(jié)核酸酶劑量以及節(jié)省載體生產(chǎn)時間外，使用RNP能減少OTE，因為其具有快速轉(zhuǎn)換率。而當(dāng)使用Cas9 mRNA時，也報道了降低的OTE。

然而，使用RNP也可以觸發(fā)某些細(xì)胞中的先天免疫反應(yīng)，導(dǎo)致CRISPR實驗中細(xì)胞毒性增加，使用化學(xué)修飾或磷酸酶處理的gRNA可以幫助減輕這些反應(yīng)并增加細(xì)胞活力。

實驗設(shè)計中控制OTE的策略（圖片來源：Journal of Biotechnology）

盡管可以采取措施減少OTE，但現(xiàn)有技術(shù)可能無法避免。出于這個原因，研究者不妨在實驗設(shè)計中采取措施來控制這些效應(yīng)，以增加對實驗結(jié)果的信心。

結(jié)語

目前，CRISPR基因組編輯技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)超越了實驗室，并且正在被開發(fā)為有望應(yīng)用于多種適應(yīng)癥的治療手段。OTE仍然是牽動CRISPR基因組編輯的臨床應(yīng)用的主要問題。全基因組測序結(jié)合傳統(tǒng)的安全性評估可能是評估每種治療劑安全性的金標(biāo)準(zhǔn)。盡管如此，預(yù)先確定如何避免OTE的策略將有助于降低開發(fā)成本以及提高基于CRISPR的療法開發(fā)的成功率。

上述的體外小化OTE的策略也可以應(yīng)用于體內(nèi)CRISPR基因組編輯。據(jù)報道，CRISPR/Cas9基因組編輯后的OTE水平遠(yuǎn)低于在細(xì)胞系中觀察到的水平，并且在大多數(shù)情況下，當(dāng)使用當(dāng)前優(yōu)化的檢測技術(shù)時，在測試的動物中沒有檢測到OTE的證據(jù)。

但總是存在引入OTE的機會，并且隨著CRISPR/Cas9在治療用途中的應(yīng)用，任何OTE都可能對患者產(chǎn)生有害影響。隨著該技術(shù)更接近于臨床環(huán)境，我們需要有更穩(wěn)健、靈敏和有效的方法來確認(rèn)OTE是否存在，以進一步增強其應(yīng)用的可信度。

參考出處：

doi: 10.1016/j.jbiotec.2018.08.007

doi: 10.1093/nar/gkw1013