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文獻背景

基本信息

摘要

研究內(nèi)容及結(jié)果

1.妊娠加重了膿毒癥

2.膿毒癥死亡率的增加與腸道菌群有關(guān)

作者為了排除腸道感染源的改變可能直接導(dǎo)致妊娠期CLP誘導(dǎo)的膿毒癥易感性增加的可能性，從NP和P小鼠中分離了盲腸細菌。分別腹腔注射來自NP和P小鼠的盲腸細菌混合物（CBMs）誘導(dǎo)的兩組膿毒癥小鼠均表現(xiàn)出相似的易感性（圖2A，S2A和S2B）。通過給廣譜抗生素（ABX）預(yù)處理3天耗盡腸道微生物群，然后對小鼠進行CLP或LPS處理，給藥ABX的腸道菌群缺失在NP和P小鼠間沒有引發(fā)任何病理變化（圖2C），在生存曲線統(tǒng)計學(xué)上無明顯差異（圖2B和2C）。作者對懷孕個體進行了糞便菌群移植（FMT）。接受NP供者糞便的NP小鼠比接受P供者糞便的NP小鼠對膿毒癥的抵抗力更強（圖2D-2F）。此外，接受P供體糞便的NP小鼠在膿毒癥期間具有更高的血清ALT活性和BALF總蛋白含量（圖2G）。在膿毒癥反應(yīng)中，接受懷孕供者糞便的NP小鼠比接受NP供者糞便的NP小鼠發(fā)生更嚴(yán)重的器官損傷。此外，在CLP后6小時，接受P供者糞便的NP小鼠的血漿細胞因子濃度高于接受NP供者糞便的NP小鼠（圖2H）。P組糞便微生物群的移植也加速了銅綠假單胞菌感染引起的膿毒癥小鼠的死亡。相反，與接受P個體糞便的P小鼠相比，NP個體的糞便移植降低了膿毒癥的高死亡率。總的來說，懷孕期間微生物組的變化足以導(dǎo)致膿毒癥的增加。

3.妊娠期間糞副擬桿菌和FMN豐度降低

16S rRNA基因測序顯示，腸道微生物群存在明顯的組間分離（圖3A和3B）。此外，懷孕引起了腸道微生物群組成的變化。線性判別分析（LDA）表明，懷孕女性和小鼠共性只有糞副擬桿菌呈下降趨勢（圖3C和3D）。主成分分析（PCA）顯示P小鼠腸道菌群代謝譜發(fā)生了顯著變化（圖3E）。火山圖和熱圖分析顯示，強效抗炎劑FMN在P小鼠中的水平較低（圖3F和S4E），靶向液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜分析進一步證實了這一點（圖3G）。與NP組相比，P組女性的FMN較少（圖3H）。

4.來自糞副擬桿菌的β-D-半乳糖苷酶是腸道中FMN的關(guān)鍵貢獻者

用ABX處理的小鼠中觀察到FMN濃度降低，這表明FMN的產(chǎn)生依賴于腸道微生物群（圖S4F）。通過綜合多組學(xué)分析，證實了樣本中糞副擬桿菌豐度與FMN豐度之間的相關(guān)性（圖3I）。此外，P組糞副擬桿菌的豐度在懷孕的人和小鼠中都有所下降，而其他物種的豐度沒有下降（圖3J，3K，S4G和S4H）。在CLP小鼠的PLF中，糞副擬桿菌豐度降低。為了進一步闡明FMN的產(chǎn)生機制，將P組糞副擬桿菌進行了全基因組測序，發(fā)現(xiàn)該菌株的基因組包含13個ORF編碼不同β-半乳糖苷酶家族成員（圖S4K）。β-D-半乳糖苷酶能以鈣依賴的方式促進小鼠FMN的釋放（圖3L）。NP和P小鼠的食物攝取量相似，F(xiàn)MN的差異主要來自于腸道中糞副擬桿菌數(shù)量。在糞副擬桿菌的基因組中存在4個編碼β-D-半乳糖苷酶成員；然而，只有ORF01166具有典型的N端信號肽，用于分泌在Ser26處有切割位點（圖3M、3N和S4N）。利用同源重組技術(shù)制備了P組糞副擬桿菌菌株ORF01166缺陷突變體（圖S4O）。缺失該基因可阻斷β-半乳糖苷酶的分泌和FMN的產(chǎn)生（圖3O-3Q）。野生型糞副擬桿菌預(yù)處理的膿毒癥小鼠的FMN濃度升高，而β-D-半乳糖苷酶缺陷突變株的FMN濃度沒有升高（圖4A）。隨著糞副擬桿菌減少，妊娠導(dǎo)致膿毒癥小鼠PLF中FMN濃度降低，表明P組糞副擬桿菌通過妊娠期間FMN的減少參與膿毒癥的進展。

5.糞副擬桿菌或FMN治療可減輕P和NP小鼠的膿毒癥的相關(guān)炎癥

ELISA檢測發(fā)現(xiàn)經(jīng)糞副擬桿菌灌胃預(yù)處理的NP組CLP小鼠血漿和PLF中TNF-α、IL-1β和IL-6均降低（圖4B和S5A）。同樣，糞副擬桿菌預(yù)處理分別提高了NP內(nèi)毒素小鼠和P組CLP小鼠的存活率（圖4C和S5B）。FMN單獨處理不會對NP小鼠產(chǎn)生毒性。FMN抑制了血漿ALT、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、Cr濃度和髓過氧化物酶（MPO）活性，并提高了CLP小鼠的存活率（圖4D和4E）。FMN減少了CLP小鼠肝、腎和肺的病變和細胞死亡（圖4F-4I）。FMN降低了CLP小鼠肺中CD11b+細胞的浸潤，這與血清中TNF-α、IL-1β、IL-6濃度的降低一致。FMN降低了CLP小鼠PLF和血液中的細菌數(shù)量（圖4J）。與FMN處理小鼠相比，對照組小鼠在LPS處理后出現(xiàn)更嚴(yán)重的膿毒癥。糞副擬桿菌中β-D-半乳糖苷酶基因缺失破壞了其對CLP小鼠MOF的預(yù)防作用（圖4K）。綜上所述，數(shù)據(jù)表明糞副擬桿菌或FMN對膿毒癥小鼠具有保護作用。

6.腸道菌群失調(diào)與妊娠期膿毒癥免疫功能障礙有關(guān)

經(jīng)CLP或LPS處理的P小鼠PLF中巨噬細胞和中性粒細胞數(shù)量減少（圖5A和S6A）。經(jīng)ABX預(yù)處理后，P型和NP型膿毒癥小鼠PLF中巨噬細胞和中性粒細胞數(shù)量相似（圖5B和S6B）。此外，與接受NP供者糞便的小鼠相比，預(yù)先給予P供者糞便的膿毒癥小鼠PLF中的巨噬細胞和中性粒細胞數(shù)量減少（圖5C，S6C和S6D）。此外，小鼠氣管內(nèi)感染銅綠假單胞菌的血液中單核細胞和中性粒細胞的減少取決于妊娠期間腸道微生物群的失調(diào)，腸道菌群失調(diào)會促進膿毒桿菌小鼠的免疫功能障礙。

7.FMN可消除膿毒癥小鼠巨噬細胞的減少

巨噬細胞的耗竭不僅加速了膿毒癥小鼠的死亡，而且降低了FMN誘導(dǎo)的對膿毒癥的保護作用（圖5D）。無論給藥與否，巨噬細胞耗竭都加劇了膿毒癥小鼠的多器官衰竭指數(shù)（圖5F和S6N）。無論給藥與否巨噬細胞耗竭損害了細菌清除，導(dǎo)致CLP小鼠血液中細菌負荷和PLF升高（圖5H）。正如研究者所預(yù)期的，糞副擬桿菌和FMN均能增加膿毒癥小鼠腹膜巨噬細胞的數(shù)量（圖5I和5J）。FMN能夠通過抑制免疫功能障礙來促進細菌清除，從而降低膿毒癥小鼠的死亡率。

8.FMN抑制膿毒癥中巨噬細胞焦亡

妊娠增加了CLP小鼠腹腔巨噬細胞的細胞死亡（圖6C），在接受P糞便的膿毒癥小鼠中觀察到類似的結(jié)果（圖6D）。FMN可降低CLP小鼠PLF中巨噬細胞死亡（圖6E）。用抑制劑VX765治療的膿毒癥小鼠腹腔巨噬細胞數(shù)量增加(圖6F)，而用其他細胞死亡抑制劑治療的小鼠腹腔巨噬細胞數(shù)量沒有增加(圖S6P)。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，F(xiàn)MN改變了LPS + ATP處理的BMDMs的基因表達譜和NOD樣受體信號通路(圖S6Q和S6R)。FMN給藥后，BMDMs中含有由LPS和ATP誘導(dǎo)的CARD (ASC)寡聚的凋亡相關(guān)斑點狀蛋白被抑制（圖6K和6L）。VX765極大地抑制了BMDMs的凋亡，而FMN沒有表現(xiàn)出額外的抑制作用（圖S6T和S6U）。FMN除巨噬細胞增加外，巨噬細胞的吞噬能力也明顯增強（圖S6V和S6W）。

9.核hnRNPUL2通過結(jié)合Nlrp3啟動子誘導(dǎo)巨噬細胞凋亡

蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，RNA結(jié)合蛋白hnRNPUL2是在LPS + ATP處理的BMDMs中FMN給藥后減少最多的蛋白(圖7A)。使用RNA干擾技術(shù)穩(wěn)定地降低了hnRNPUL2在BMDMs中的表達(圖S7B)。hnRNPUL2的基因沉默導(dǎo)致ASC寡聚化的抑制和細胞死亡的減少(圖S7C-S7F)。免疫沉淀分析顯示FMN在體外直接與hnRNPUL2相互作用(圖S7H)。熒光染色顯示，F(xiàn)MN增強了hnRNPUL2和溶酶體在LPS + ATP處理的BMDMs中的共定位。hnRNPUL2直接與BMDMs中Nlrp3的啟動子區(qū)結(jié)合(圖S7K)。FMN顯著降低了LPS + ATP處理Raw264.7細胞中Nlrp3啟動子的轉(zhuǎn)錄活性(圖S7L)。

10.糞副擬桿菌的菌群失調(diào)通過FMN-hnRNPUL2-NLRP3軸增強了膿毒癥的易感性

腺相關(guān)病毒沉默了小鼠hnRNPUL2(AAV)介導(dǎo)的傳遞技術(shù)(圖S7M)。hnRNPUL2的遺傳沉默改善了CLP小鼠的存活率和減毒MOF(圖7M、7N和S7N)。糞副擬桿菌的豐度與膿毒癥患者血漿降鈣素原(PCT)和Cr濃度呈負相關(guān)(圖7O)。同時，膿毒癥患者腸道FMN含量與血清ALT和AST濃度呈負相關(guān)(圖7P)。綜上所述，揭示了糞副擬桿菌的菌群失調(diào)在介導(dǎo)免疫軸FMN-hnRNPUL2-NLRP3中的意義，該軸通過誘導(dǎo)膿毒癥患者巨噬細胞焦亡進而引起免疫功能障礙。

結(jié)論

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