文獻(xiàn)背景
膀胱癌（BCa）是男性第四常見惡性腫瘤，也是女性常見的惡性腫瘤，復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高。在BCa患者中，約75%為非肌肉浸潤性膀胱癌（NMIBC）。這些患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方法是經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)（TURBT）后進(jìn)行膀胱內(nèi)化療或免疫治療。然而30-80%的NMIBC患者在初次手術(shù)治療后5年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)，產(chǎn)生巨大的醫(yī)療費(fèi)用。研究表明，不良復(fù)發(fā)的原因是TURBT不*，膀胱灌注效率低導(dǎo)致殘留腫瘤持續(xù)或再生。臨床上的膀胱內(nèi)滴注化療藥物，由于在尿液滯留和排泄過程中的周期性稀釋和沖洗，無法在殘留的腫瘤區(qū)域精確地維持持續(xù)有效的藥物濃度。盡管已經(jīng)開發(fā)了合并納米載體和藥物遞送系統(tǒng)以優(yōu)化給藥，但有限的療效和未滿足的安全性（如尿路梗阻和膀胱刺激的風(fēng)險(xiǎn)）限制了其臨床應(yīng)用。因此，為準(zhǔn)確和*地殺死殘留的腫瘤，迫切需要智能和安全的膀胱內(nèi)制劑，即使在復(fù)雜的靜脈內(nèi)環(huán)境中也能實(shí)現(xiàn)精確的藥物富集和長期釋放。
臨床上，TURBT優(yōu)于膀胱內(nèi)灌注。TURBT手術(shù)床不同于正常的尿路上皮，是殘留腫瘤周圍的特殊環(huán)境。它提供一個(gè)現(xiàn)成的特異性靶向平臺(tái)，藥物可以定位并直接進(jìn)入殺死潛在的殘留腫瘤細(xì)胞。雖然靶向手術(shù)床能夠?qū)堄嗄[瘤起到充分的殺傷作用，但膀胱這種pH值和滲透壓不斷變化的復(fù)雜液體環(huán)境，長期穩(wěn)定的靶向作用是其臨床應(yīng)用的主要挑戰(zhàn)。由于失去了皮膚等表層屏障的保護(hù)，細(xì)菌感染更容易發(fā)生在手術(shù)或燒傷等傷口上。細(xì)菌感染對(duì)傷口的偏好可能為解決手術(shù)床定位問題提供新的思路。細(xì)菌感染由與宿主細(xì)胞的黏附引起，宿主細(xì)胞上的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）包括纖連蛋白（FN）、膠原蛋白、層粘連蛋白等通過細(xì)菌表面上的一組特定ECM附著分子為細(xì)菌直接黏附提供天然和多分子成分。在外部屏障被破壞后，損傷可能會(huì)暴露更多的ECM成分，從而增加穩(wěn)定細(xì)菌黏附的機(jī)會(huì)（方案1a）?？ń槊纾˙CG）是一種活的、減毒的牛分枝桿菌菌株，它可以通過手術(shù)特異性粘附于破壞的尿路上皮而不在正常的尿路上皮表面附著，這啟發(fā)作者實(shí)現(xiàn)膀胱手術(shù)床的特異性靶向。有文獻(xiàn)表明BCG特異性附著是由兩種成分介導(dǎo)的：BCG表面FN附著蛋白的FN結(jié)合肽（FBP）和TURBT手術(shù)暴露在手術(shù)床上的FN。
方案1
多肽除了具有生物相容性外還具有結(jié)構(gòu)和生物活性，是一種理想的生物材料。對(duì)多肽自組裝特性的研究不僅揭示了從納米粒子、納米纖維到納米網(wǎng)絡(luò)的一系列形態(tài)，而且拓寬了其在生物體中的應(yīng)用。作者代表性研究表明一系列自組裝肽可以在實(shí)體瘤中原位特異而牢固地形成3D纖維網(wǎng)絡(luò)，具有高蓄積性和長期滯留，用于歸巢治療藥物、抑制轉(zhuǎn)移等。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)，自組裝肽基材料有望構(gòu)建理想的藥物遞送系統(tǒng)，即使在流動(dòng)和沖洗的膀胱內(nèi)環(huán)境中，該系統(tǒng)也能在殘留腫瘤部位精確分布并延長滯留時(shí)間。
受細(xì)菌衍生的FN結(jié)合肽和暴露的FN之間的分子識(shí)別，特異性細(xì)菌粘附到傷口的啟發(fā)，作者將這種肽引入自組裝肽系統(tǒng)，并開發(fā)了細(xì)菌啟發(fā)的可轉(zhuǎn)化納米粒子（BTN）。BTN肽由三個(gè)基序組成：（1）FN結(jié)合肽（GNRQRWFVVWLG）作為靶向基序，（2）氫鍵肽（KLVFF）作為自組裝基序，（3）十二烷基鏈作為疏水基序（方案1b）。最初，BTN肽可以自組裝成納米BTN，并包裹阿霉素（DOX）以獲得具有十二烷基和KLVFF基序疏水核心的DOX@BTN。DOX@BTN的工作原理如方案1c所示。（1）細(xì)菌引起的粘連：首先將DOX@BTN膀胱內(nèi)給藥，并在術(shù)后手術(shù)部位暴露FN。DOX@BTN在FN結(jié)合肽的引導(dǎo)下精確靶向暴露的FN，從而附著在殘留腫瘤上。（2）轉(zhuǎn)化和藥物濃縮：疏水核心限制KLVFF堆疊在一起并形成組織良好的分子間氫鍵。一旦與靶標(biāo)FN結(jié)合，BTN的配體與FN之間的結(jié)合力就打破了BTN疏水親水平衡的限制，啟動(dòng)了氫鍵肽之間的分子間氫鍵作用。因此，BTN從納米顆粒轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂?beta;-折疊二級(jí)結(jié)構(gòu)的納米纖維（NFs），進(jìn)一步形成覆蓋殘留腫瘤的纖維涂層。NFs中的疏水域很容易通過疏水和π-π相互作用捕獲和儲(chǔ)存DOX，從而豐富手術(shù)部位中的化療藥物。DOX@BTN確保DOX的精確富集和延長釋放，不受周期性排尿的影響，直接有效地殺死殘留的膀胱癌細(xì)胞并減少膀胱癌的復(fù)發(fā)（方案1c）。
基本信息
摘要
不*手術(shù)留下的殘余腫瘤再生導(dǎo)致膀胱癌復(fù)發(fā)。術(shù)后膀胱內(nèi)灌注治療因藥物排空快、非特異性分布等原因，臨床對(duì)復(fù)發(fā)的抑制效果不理想。作者受細(xì)菌通過纖維連接蛋白結(jié)合肽與裸露傷口內(nèi)在黏附的啟發(fā)，開發(fā)了一種細(xì)菌激發(fā)的多肽納米顆粒，靶向手術(shù)中腫瘤殘留暴露的纖維連接蛋白。納米顆粒結(jié)合后轉(zhuǎn)化為纖維涂層，作為藥物儲(chǔ)庫長期釋放包裹的阿霉素。在灌注3天后，可轉(zhuǎn)化納米顆粒在小鼠膀胱內(nèi)保留的阿霉素濃度比游離的高8.5倍。在不*腫瘤切除模型中，這種配方明顯抑制了腫瘤的再生長。與臨床阿霉素治療相比，在小鼠原位膀胱癌模型中，它將復(fù)發(fā)率從71%降低到29%。這種生物材料不僅提供了一種膀胱內(nèi)治療方法，也為癌癥復(fù)發(fā)的臨床治療提供了機(jī)會(huì)。
研究內(nèi)容及結(jié)果
1.溶液中BTN與FN結(jié)合轉(zhuǎn)化行為的表征
根據(jù)固相多肽合成方法（圖S1），作者合成了FN可靶向和可轉(zhuǎn)化的C12-KLVFF-GNRQRW-FVVWLG型BTN多肽，以及兩個(gè)對(duì)照肽C1-BTN多肽（C12-KLVFF-GVRLWVQFRNWG）和C2-BTN多肽（C12-KAAGG-GNRQRWFVVWLG）。C1-BTN肽含有FN結(jié)合肽的自組裝基序，但不是靶向的擾亂序列。C2-BTN多肽具有FN靶向基序，但缺乏自組裝序列。因此，C1-BTN和C2-BTN都被設(shè)計(jì)成不能轉(zhuǎn)化為纖維結(jié)構(gòu)。采用快速沉淀法制備納米BTN和對(duì)照BTN（40μM，H2O:DMSO = 99:1，v/v）。作者嘗試探索包括FN結(jié)合肽的BTN是否保留了特定的FN靶向能力。從黏附陣列（圖1A）可以發(fā)現(xiàn)BTN和C2-BTN對(duì)預(yù)包覆的FN層的結(jié)合能力分別是C1-BTN（擾亂靶向序列）的2.7和2.4倍，表明FN結(jié)合肽賦予納米FN靶向能力。BTN與FN的結(jié)合能力分別是牛血清白蛋白（BSA）、膠原和層粘連蛋白的4.3、3.0和3.6倍，表明BTN具有與FN的特異性結(jié)合能力。另外通過分子動(dòng)力學(xué)模擬預(yù)測(cè)了BTN在FN內(nèi)的結(jié)合域。FN的第13型結(jié)構(gòu)域（即FNIII13）在所選的FN結(jié)構(gòu)域（FN的7-10、11、12、13和14-16型結(jié)構(gòu)域）中范德華和庫侖相互作用能最大，表明BTN與FNIII13結(jié)合較強(qiáng)（圖S2）。然后，根據(jù)FN結(jié)合肽RWFV序列中結(jié)合能低、活性位點(diǎn)最多的位點(diǎn)，通過分子對(duì)接，篩選出較好的蛋白肽結(jié)合模型（即FNIII13-BTN肽）。目標(biāo)基序的VWLG序列與FN的T11，K19，I20，Y22，E23，E53，D55，A57之間發(fā)生了大的疏水相互作用（圖1b）。BTN肽和FN通過分子對(duì)接的代表性結(jié)合結(jié)構(gòu)，這種結(jié)合引發(fā)了BTN到納米纖維的轉(zhuǎn)化（圖1c）。
圖S1
圖S2
圖1
通過透射電子顯微鏡（TEM）和動(dòng)態(tài)光散射（DLS）研究FN誘導(dǎo)的BTN轉(zhuǎn)變。添加FN在37℃下1小時(shí)，可觀察到平均直徑為10.8 nm的NFs，而在相同條件下，未添加FN的BTN仍保持納米級(jí)結(jié)構(gòu)（圖1d；圖S3）。無論是否在37℃下添加FN 1小時(shí)，C1-BTN和C2-BTN都只表現(xiàn)出納米形貌（圖S3）。單獨(dú)的FN在透射電鏡下既沒有完整的ECM呈現(xiàn)明顯的納米連接也沒有纖維狀網(wǎng)絡(luò)，而是呈現(xiàn)單體形態(tài)（圖S4）。BTN在37℃下與FN孵育1h后，其平均流體力學(xué)直徑從68.1 nm變?yōu)槎喾稚⒌?20.0和955.0 nm，表明BTN向非硝基氮化物轉(zhuǎn)變，但在沒有FN孵育的BTN溶液中只檢測(cè)到直徑的微小變化（圖1E）。DLS數(shù)據(jù)顯示C1-BTN和C2-BTN在直徑w/wo FN范圍內(nèi)變化不大（圖S5）。通過圓二色譜（CD）分析BTN多肽在轉(zhuǎn)化過程中的二級(jí)結(jié)構(gòu)。BTN與FN孵育1 h后CD信號(hào)特征明顯，在195 nm處CD信號(hào)為正，在216 nm處CD信號(hào)為負(fù)，表明BTN在FN誘導(dǎo)下通過氫鍵相互作用自組裝成富含β折疊結(jié)構(gòu)的NFs（圖1f）。但由于缺乏可變性C1-BTN和C2-BTN w/wo FN都沒有表現(xiàn)出典型的β折疊結(jié)構(gòu)特征信號(hào)。隨著BTN肽濃度的增加，BTN的CD光譜顯示出更多特征性的β折疊結(jié)構(gòu)CD信號(hào)（在195 nm處為正CD信號(hào)，在216 nm處為負(fù)CD信號(hào)）。根據(jù)CD光譜估計(jì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，隨著BTN濃度從10增加到40μM，β-折疊二級(jí)結(jié)構(gòu)的比例升高，高于CMC（5.46 μM）（圖S6）。通過傅里葉變換紅外光譜（FTIR）進(jìn)一步研究了所得NFs的詳細(xì)堆積結(jié)構(gòu)。FN孵育1小時(shí)后，BTN在酰胺I區(qū)1633cm-1處顯示出代表C═O拉伸振動(dòng)的特征帶，表明NFs中存在平行β折疊結(jié)構(gòu)（圖1g）。富含β-折疊聚集體的熒光探針硫黃素T（ThT，10 μM）用于評(píng)估自組裝進(jìn)展。于形成了β折疊結(jié)構(gòu)的神經(jīng)纖維，BTN+FN組的熒光強(qiáng)度比BTN組增加了4倍。在激光共聚焦掃描顯微鏡下，F(xiàn)N處理的BTN溶液中可見明顯的增強(qiáng)熒光的纏繞纖維聚集，表明形成了具有β折疊結(jié)構(gòu)的NFs（圖1H），而FN單獨(dú)處理組和FN處理的C1/C2-BTN組顯示出黑色的背景，沒有明顯的熒光集合體（圖S7）。通過分子動(dòng)力學(xué)模擬研究BTN的形態(tài)轉(zhuǎn)變。在80 ns內(nèi)，BTN在FN誘導(dǎo)下呈現(xiàn)由粒子向纖維轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)，而C1-BTN和C2-BTN的構(gòu)象沒有明顯變化（圖S8）。上述結(jié)果表明，BTN向NFs的轉(zhuǎn)化過程由GNRQRWFVVWLG與FN結(jié)合啟動(dòng)，隨后KLVFF通過分子間氫鍵自組裝驅(qū)動(dòng)。
圖S3
圖S4
圖S5
圖S6
圖S7
圖S8
2.體外BTN精確結(jié)合、自組裝和長時(shí)間滯留
在確認(rèn)轉(zhuǎn)化特性是由FN結(jié)合和兩個(gè)序列的自組裝雙重支配后（圖2a），用多細(xì)胞球狀體（MCSs）驗(yàn)證FN的特異性粘附和向NFs的轉(zhuǎn)化。首先，用ELISA法檢測(cè)加入轉(zhuǎn)化生長因子-β的正常成纖維細(xì)胞L929和人胚胎腎細(xì)胞HEK293中FN的差異表達(dá)。經(jīng)轉(zhuǎn)化生長因子-β處理的L929細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分泌的FN是HEK293細(xì)胞的25.2倍（圖2B）。將TGF-β處理的L929細(xì)胞作為FN+組，HEK293細(xì)胞作為FN-組。Cy5標(biāo)記的BTN、C1/C2-BTN（40 μM，培養(yǎng)基:DMSO=99:1，v/v）分別與FN+或FN- MCS孵育1小時(shí)，用PBS洗去后用CLSM觀察。用Cy5標(biāo)記的BTN和C1/C2-BTN培養(yǎng)的FN-HEK293 MCS在沖洗后的熒光可忽略不計(jì)。相比之下，與Cy5標(biāo)記的BTN和C2-BTN孵育的FN+（L929 + TGF-β）MCSs顯示陽性熒光信號(hào)（圖2c），分別比Cy5標(biāo)記的C1-BTN孵育的MCSs高4.4倍和3.8倍（圖2d）。結(jié)果與結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果一致（圖1a），進(jìn)一步證實(shí)了BTN的特異性FN結(jié)合能力。
圖2
作者進(jìn)一步研究了BTN向NFs的轉(zhuǎn)化以及相應(yīng)的體外生物保留能力。將MCSs與Cy5標(biāo)記的BTN和C2-BTN共同孵育6h，分別于第0、1、2、3、4、5天觀察，每次觀察前更換MCSs的培養(yǎng)液。如圖2e和圖2f所示，在Cy5標(biāo)記的BTN和C2-BTN組中，在第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)都檢測(cè)到比較熒光。C2-BTN組第二天熒光信號(hào)急劇衰減，第三天出現(xiàn)微弱的熒光信號(hào)，相比之下BTN處理的MCSs顯示出長期的熒光信號(hào)。第5天BTN組的剩余熒光強(qiáng)度仍達(dá)到初始熒光強(qiáng)度的60.1%，幾乎是C2-BTN組的兩倍（圖2e，f）。這種長時(shí)間的熒光可能是因?yàn)锽TN轉(zhuǎn)化成的NFs型，它牢固地附著在MCSs上，耐洗滌并長期保留。為了驗(yàn)證BTN的牢固附著，使用掃描電子顯微鏡（SEM）直接觀察經(jīng)BTN處理1h后的MCSs表面。在MCSs上觀察到纏繞的纖維網(wǎng)絡(luò)，可能是來自BTN的交織的NFs，驗(yàn)證了牢固的附著。相比之下C2-BTN處理的MCS的表面呈現(xiàn)出相對(duì)光滑的外觀，表明C2-BTN在培養(yǎng)基更換期間被洗去（圖2g）。經(jīng)Cy5標(biāo)記BTN處理的L929 MCSs用ThT進(jìn)行染色，CLSM圖像不僅顯示ThT在480 nm處的綠色發(fā)射熒光增強(qiáng)，而且與Cy5的紅色熒光共域，Pearson相關(guān)系數(shù)（PCC）為0.77，提示MCSs中具有β折疊結(jié)構(gòu)的NFs（圖2h）。C2-BTN組的ThT熒光顯示較低的PCC（0.56），Cy5標(biāo)記的C2-BTN熒光呈紅色，表明C2-BTN的β折疊結(jié)構(gòu)較少。綜上所述，這些結(jié)果表明BTN可在細(xì)胞微環(huán)境中與FN牢固結(jié)合，并在MCSs上自組裝成具有β折疊結(jié)構(gòu)的相互交織的NFs，從而延長滯留時(shí)間，可作為化療藥物的富集和緩釋庫。
3.小鼠膀胱內(nèi)BTN的靶向、轉(zhuǎn)化和滯留
為驗(yàn)證TURBT手術(shù)前后靶向FN的定位，對(duì)C57BL/6小鼠和人的膀胱組織進(jìn)行分析。小鼠模型采用鹽酸剝蝕損傷尿路上皮完整性的方法模擬手術(shù)對(duì)小鼠尿路上皮的損傷。小鼠膀胱組織免疫組化研究顯示FN位于完整的尿路上皮下，鹽酸剝蝕后出現(xiàn)在管腔表面。在正常和損傷的膀胱組織上用電灼法觀察到同樣的現(xiàn)象。這些結(jié)果表明術(shù)后FN將暴露在手術(shù)床上，驗(yàn)證了靶標(biāo)的可靠性（圖3a，b）。以此為靶點(diǎn)進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)，以評(píng)價(jià)BTN在體內(nèi)的結(jié)合、轉(zhuǎn)化和滯留情況。用酸剝離法損毀小鼠膀胱，然后分別注入染料標(biāo)記的BTN、C1-BTN和C2-BTN，每組3只。灌胃后1h處死小鼠，取膀胱組織進(jìn)行免疫熒光染色。Cy5標(biāo)記的BTN和C2-BTN的紅色熒光出現(xiàn)在膀胱內(nèi)壁，并與FN熒光信號(hào)（綠色）有很好的共定位。與C1-BTN孵育的膀胱只有綠色熒光，幾乎沒有紅色熒光。（圖3C；圖S9）。利用體內(nèi)成像系統(tǒng)（IVIS）對(duì)體外膀胱的熒光成像，Cy7標(biāo)記的BTN組的熒光信號(hào)與Cy7標(biāo)記的C2-BTN組相當(dāng)，但比非靶向C1-BTN組高4.4倍（圖3D）。這些結(jié)果表明，纖維連接蛋白結(jié)合肽的FN靶向性有助于BTN和C2-BTN在體內(nèi)的積累。
圖3
圖S9
作者使用小鼠原位膀胱模型（n=3）進(jìn)一步研究了BTN和C2-BTN在膀胱內(nèi)的滯留，該模型提供了具有動(dòng)態(tài)流體環(huán)境的人類膀胱的真實(shí)模擬。將Cy7標(biāo)記的BTN和C2-BTN注入酸蝕的膀胱。膀胱區(qū)的熒光信號(hào)以時(shí)間依賴的方式被監(jiān)測(cè)和量化（圖3e，f）。BTN治療組膀胱內(nèi)熒光信號(hào)從4 h開始減弱，但速度相對(duì)較慢，在膀胱內(nèi)排尿時(shí)表現(xiàn)出較好的抗排尿能力，而C2-BTN組在注射后12 h內(nèi)迅速下降。BTN組在72 h仍可觀察到清晰的BTN熒光信號(hào)，而C2-BTN組在42 h后未見明顯的熒光信號(hào)。每組的保留效率以起始熒光信號(hào)的百分比為指標(biāo)，72 h時(shí)BTN組為21.0±5.7%，是C2-BTN組（3.2±0.9%）的6.6倍（圖3e，f）。在心、肺、脾等系統(tǒng)器官中，幾乎沒有熒光信號(hào)，表明BTN膀胱內(nèi)灌注的生物安全性（圖S10）。最后，使用Bio-TEM和掃描電子顯微鏡分別驗(yàn)證了受損膀胱中的纖維涂層和交織纖維涂層（圖3g）。生物顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)BTN組大鼠膀胱內(nèi)壁表面有明顯的纖維結(jié)構(gòu)，而C2-BTN組大鼠膀胱內(nèi)壁表面無明顯纖維結(jié)構(gòu)（圖3h）。相應(yīng)的能量色散光譜（EDS）分析也鑒定了碘標(biāo)記的BTN多肽在纖維結(jié)構(gòu)上產(chǎn)生的I特征信號(hào)（圖S11）。通過掃描電鏡觀察到BTN組擴(kuò)張性膀胱壁呈纖維狀包膜（圖3i），而在C2-BTN處理的膀胱內(nèi)腔表面無纖維結(jié)構(gòu)，可見少量顆粒狀碎片。在活鼠膀胱中，BTN能精確靶向手術(shù)床自組裝成NFs，牢固地附著在膀胱內(nèi)表面。這些結(jié)果為活體小鼠手術(shù)床中BTN的高積累和長期滯留提供了直接證據(jù)，這對(duì)藥物的富集和持續(xù)釋放至關(guān)重要。
圖S10
圖S11
4.在模擬手術(shù)床中，DOX@BTN的DOX富集和長期釋放
據(jù)報(bào)道小分子傾向于通過疏水和π-π相互作用插入肽納米結(jié)構(gòu)中。BTN通過捕獲和儲(chǔ)存疏水性化療藥物，可作為一個(gè)藥庫。首先，用芘熒光探針法測(cè)定BTN和對(duì)照C2-BTN多肽的臨界膠束濃度（CMC）來評(píng)價(jià)包封性。BTN和C2-BTN的CMC值分別為5.46和11.13 μM，表明BTN比C2-BTN更傾向于膠束化，可能具有更強(qiáng)的包封效率（圖S12a，b）。DOX通過共組裝加載到BTN（DOX@BTN）和C2-BTN（DOX@C2-BTN）中。DOX@BTN和DOX@C2-BTN的紫外可見吸收光譜在485 nm處出現(xiàn)了DOX的特征峰（圖S12c，d）。與C2-BTN相比BTN的包封率（37.3% vs 26.3%）和載藥效率（27.2% vs 20.9%）分別提高了1.4倍和1.3倍，可能與BTN的疏水區(qū)域更大有關(guān)。分子動(dòng)力學(xué)模擬顯示在80 ns時(shí)，DOX在BTN中比C2-BTN中分布更集中。DOX@BTN與DOX@C2-BTN相比，DOX的溶劑可及表面積（SASA）更低，說明BTN具有較高的包封能力（圖S12e）。以質(zhì)量比（BTN/DOX，0.16，0.5，0.6，1.1，1.6）為標(biāo)準(zhǔn)，采用透析法制備不同批次的DOX包埋BTN。隨著DOX含量的增加，載藥效率提高達(dá)到30%左右，包封效率降低（圖S12f）。為確定DOX負(fù)載納米顆粒的轉(zhuǎn)化性質(zhì)用透射電鏡和DLS表征在FN誘導(dǎo)下DOX@BTN、C1-BTN和C2-BTN的形態(tài)和尺寸分布。與未載藥的納米顆粒一致，只有經(jīng)FN處理1 h的DOX@BTN出現(xiàn)了明顯的由納米顆粒向納米纖維的形態(tài)轉(zhuǎn)變和DLS變化，盡管有FN誘導(dǎo)，DOX@C1-BTN、DOX@C2-BTN仍保持納米顆粒的形態(tài)，納米顆粒大小變化不大（圖4a；圖S13）。在與FN孵育1 h后，DOX@C2-BTN的顆粒尺寸變小，這表明FN結(jié)合可能介導(dǎo)了納米顆粒的解離。通過平衡透析繪制藥物釋放曲線，研究BTN向NFs轉(zhuǎn)化過程中DOX的釋放行為（圖S14a）。將DOX@BTN、DOX@C1-BTN和DOX@C2-BTN與FN混合后分別加入透析膜中。將DOX@BTN與FN（20nM）孵育2 h后，直接制備DOX@NFs進(jìn)行透析。在FN的誘導(dǎo)下，DOX@C2-BTN（無自組裝基序）在120 h內(nèi)快速釋放了57.8%的DOX，而DOX@C1-BTN（FN結(jié)合肽的雜亂序列）在120 h內(nèi)釋放緩慢，釋放量最少（16.9%）。對(duì)于有NFs形成的組，DOX@BTN與FN和DOX@NFs混合后的DOX存儲(chǔ)量分別為71.9%和70.2%，顯示出DOX的持續(xù)釋放，長期藥物暴露殺死癌細(xì)胞。曲線顯示與DOX@NFs相比，DOX@BTN+FN在前4 h表現(xiàn)出相對(duì)較快的釋放，這一快速釋放階段可能是由于結(jié)合FN啟動(dòng)了從納米BTN到NFs的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。C1-BTN的緩釋行為可能是由于FN失去了啟動(dòng)轉(zhuǎn)化的靶向性。DOX@BTN+FN組在4 h后表現(xiàn)出緩釋特征，這意味著DOX仍然存儲(chǔ)在NFs中（圖S14a）。這些結(jié)果證實(shí)盡管通過FN結(jié)合增加了藥物釋放，轉(zhuǎn)化的NFs通過捕獲DOX在NFs中成為藥物保留的主導(dǎo)。計(jì)算包含DOX@BTN和FN在80 ns內(nèi)的均方根（RMSD）值。與DOX@C2-BTN-FN相比，DOX@BTN的RMSD變化較小，表明DOX@BTN具有緩釋性質(zhì)（圖S14b）。
圖S12
圖4
圖S13
圖S14
為了驗(yàn)證DOX@BTN具有靶向和長期抗癌作用的*性，使用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析（RTCA）來動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)DOX@BTN對(duì)細(xì)胞活力的影響，同時(shí)進(jìn)行常規(guī)CCK-8檢測(cè)（圖S15）。圖4b演示了實(shí)驗(yàn)方法。為提供豐富的靶細(xì)胞（FN）以便更好地轉(zhuǎn)化，在RTCA孔的底部預(yù)涂FN，然后接種膀胱癌細(xì)胞（MB49），*模擬了一個(gè)含有癌細(xì)胞殘留的體外傷口。DOX@BTN和游離DOX（臨床傳統(tǒng)治療方式作為對(duì)照）在MB49附著生長后添加。1小時(shí)后用無DOX培養(yǎng)液更換上清液以模擬尿液沖洗，同時(shí)記錄細(xì)胞存活率（圖4b）。兩組細(xì)胞存活率在 4h內(nèi)先略有升高，之后逐漸下降。DOX@BTN組的下降速度明顯快于游離DOX組。在72 h時(shí)，DOX@BTN對(duì)細(xì)胞活力的抑制作用明顯強(qiáng)于游離DOX（圖4c）。為證實(shí)在體外創(chuàng)傷模擬RTCA模型中是否形成了由納米纖維組成的纖維涂層，使用掃描電子顯微鏡觀察了預(yù)涂有FN的RTCA孔上的細(xì)胞（圖4d）。如圖4e所示，在DOX@BTN孵育1 h的細(xì)胞周圍觀察到成簇的纖維涂層，但游離DOX處理1 h后細(xì)胞仍保持黏附，沒有纖維涂層，由于沖刷，細(xì)胞背景清晰。培養(yǎng)上清與DOX或DOX@BTN孵育1 h后更換，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。掃描電鏡顯示DOX@BTN組細(xì)胞被纖維包膜覆蓋，細(xì)胞縮小碎裂，游離DOX組細(xì)胞與1 h時(shí)情況相似，背景清晰，無額外結(jié)構(gòu)（圖4e）。這些結(jié)果清楚地證明了在MB49細(xì)胞周圍形成由NFs組成的纖維涂層的證據(jù)，表明DOX@BTN通過與FN結(jié)合靶向并覆蓋MB49細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)DOX的長期殺傷作用的持續(xù)釋放。
圖S15
基于在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)交織纖維涂層的高蓄積和長時(shí)間滯留，作者測(cè)試了纖維交織涂層對(duì)DOX的耐尿性和緩釋行為。酸蝕膀胱組灌胃阿霉素，同時(shí)灌胃游離阿霉素（0.5 mg/mL，相當(dāng)于920 μM）。收集尿液中釋放的DOX，在不同時(shí)間間隔內(nèi)進(jìn)行測(cè)量（圖4f）。尿液中的DOX濃度反映了膀胱內(nèi)的藥物含量。經(jīng)膀胱內(nèi)給藥可使DOX在膀胱內(nèi)定位，直接到達(dá)癌灶，發(fā)揮最大的治療效果。如圖4g所示，游離DOX組在16 h內(nèi)快速排泄，導(dǎo)致藥物快速消耗。DOX@BTN組藥物排泄緩慢，24 h后尤為明顯。DOX@BTN處理膀胱排出的DOX濃度顯著高于未處理膀胱排出的DOX濃度。DOX@BTN處理后膀胱72 h釋放的DOX濃度為11.8 μM，仍高于游離DOX的IC50值（1.4 μM），是游離DOX對(duì)照組的8.4倍（圖4g，圖S15）。將DOX@BTN和游離DOX分別與電灼傷小鼠的體外膀胱孵育。與游離DOX組相比，DOX@BTN組開放膀胱在靶區(qū)即手術(shù)床上顯示出較強(qiáng)的DOX熒光，證實(shí)了手術(shù)床內(nèi)藥物的精確濃縮。DOX@BTN組手術(shù)床上DOX的熒光強(qiáng)度（信號(hào)）與正常膀胱壁（噪聲）的比值是游離DOX組的2.2倍（圖S16）。結(jié)果證實(shí)DOX@BTN通過與暴露的FN結(jié)合，能夠特異性地靶向手術(shù)床，并有效地保留了DOX在體內(nèi)的長期抗腫瘤作用。
圖S16
5.DOX@BTN對(duì)不*腫瘤切除模型的殘留腫瘤抑制作用
作者進(jìn)一步評(píng)估了DOX@BTN對(duì)膀胱殘余腫瘤再生的抑制作用。首先，將MB49-Luc細(xì)胞移植到皮下制備異種移植瘤。14天后，腫瘤被摘除并縫合，留下可見微小腫瘤病變（不到原始腫瘤體積的1%）的空洞作為殘余腫瘤。手術(shù)后生物發(fā)光的顯著減少驗(yàn)證了殘余腫瘤的成功制備（圖S17）。將四種制劑（PBS、DOX和BCG作為臨床對(duì)照，DOX@BTN）注射到切除腔中，然后在每次治療后用PBS沖洗，建立模型的步驟很好地模擬了臨床膀胱內(nèi)灌注的過程（圖5a）。DOX@BTN組6只小鼠中有2只在治療結(jié)束時(shí)未見明顯腫瘤，其余3組小鼠均腫瘤復(fù)發(fā)。PBS治療的腫瘤在不*切除后隨時(shí)間呈指數(shù)增長，在結(jié)束時(shí)間點(diǎn)平均腫瘤體積達(dá)到553.5 mm3。DOX組腫瘤生長明顯延遲，截止時(shí)間平均腫瘤體積為257.1 mm3。BCG組腫瘤被中度抑制，平均腫瘤體積為384.7 mm3，可能是由于人工腔內(nèi)缺乏免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)所致。DOX@BTN顯示出對(duì)殘余腫瘤再生的有效抑制，平均腫瘤體積為100.7mm3（圖5b，c）。通過免疫組織化學(xué)和H&E染色證實(shí)了腫瘤摘除后腔內(nèi)殘留腫瘤負(fù)荷的豐富FN表達(dá)，成功模擬了不*TURBT后FN暴露的殘留腫瘤。因此DOX@BTN能夠結(jié)合并保留在手術(shù)床上進(jìn)行精確的藥物釋放，對(duì)殘留腫瘤的復(fù)發(fā)具有優(yōu)異的抑制效果（圖5d；圖S18）。此外，DOX@BTN治療的小鼠體重幾乎沒有受到影響，并且顯著高于DOX組（圖5e）。所有結(jié)果證實(shí)轉(zhuǎn)化為NFs后的DOX@BTN可作為具有長期腫瘤殺傷作用的化療藥物庫，降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。為評(píng)價(jià)DOX@BTN的安全性，在終點(diǎn)采集血樣和主要器官。測(cè)定血清ALT、AST、ALP、TP、ALB、GLOB、CRE、BUN等生化指標(biāo)。DOX@BTN組與PBS組無明顯差異，說明DOX@BTN組無系統(tǒng)性毒性（圖S19a-c）。多器官病理切片結(jié)果表明特異性富集和長期保留的DOX@BTN不會(huì)引起不良的病理改變（圖S19d）。
圖S17
圖5
圖S18
圖S19
6.DOX@BTN對(duì)小鼠原位膀胱癌復(fù)發(fā)的抑制作用
作者進(jìn)一步研究了DOX@BTN在小鼠原位膀胱腫瘤模型中的療效（圖6a）。將MB49-luc細(xì)胞植入小鼠膀胱，用IVIS實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)小鼠的動(dòng)態(tài)，通過生物發(fā)光成像記錄腫瘤生長（圖6b）。所有小鼠在腫瘤孵育后第3天的膀胱中都顯示出類似的微弱生物發(fā)光信號(hào)，這表明發(fā)育良好的微小腫瘤病灶模擬了最小的殘留腫瘤。為更好地刺激術(shù)后環(huán)境，用24-G留置針抓撓膀胱內(nèi)壁，使傷口更多地暴露FN。之后根據(jù)膀胱術(shù)后的臨床給藥情況，分別于不同時(shí)間點(diǎn)（第3、5、7、10、17、24天）將PBS、DOX、BCG、DOX@BTN 4種膀胱內(nèi)配方注入小鼠膀胱（n = 7）。PBS組小鼠腫瘤復(fù)發(fā)，7只小鼠中有2只在1個(gè)月內(nèi)死亡。BCG治療組小鼠腫瘤復(fù)發(fā)控制增強(qiáng)，復(fù)發(fā)率為57%，而游離DOX組為71%，這與TURBT后BCG在預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)方面優(yōu)于TURBT后化療的臨床結(jié)果相一致。與不*切除模型相比，原位模型中BCG療效的提高可能與更真實(shí)的生理?xiàng)l件有關(guān)，具有更好的藥代動(dòng)力學(xué)特性和完整的生物活性，如血管正常，有利于抗原呈遞和免疫細(xì)胞的募集。這也可能是由于不*切除實(shí)體瘤，但切除了大部分實(shí)體瘤后，腫瘤負(fù)荷比治療前的原位模型更大。與其他組相比，DOX@BTN治療的小鼠明顯表現(xiàn)出腫瘤生長抑制。DOX@BTN治療明顯降低了腫瘤復(fù)發(fā)率，從71或57-29%（DOX或BCG vs DOX@BTN）（圖6c，d）。DOX@BTN治療對(duì)體重的影響與不*切除模型的結(jié)果一致（圖6e）。此外，DOX@BTN治療能顯著延長小鼠的生存時(shí)間。7只小鼠中有5只存活超過60天，而PBS組、DOX組和BCG組中存活天數(shù)分別為33、43和49天（圖6f）。這些結(jié)果表明，DOX@BTN通過FN靶點(diǎn)抑制原位膀胱腫瘤的復(fù)發(fā)表現(xiàn)出優(yōu)異的療效。為進(jìn)一步證實(shí)癌殘留膀胱內(nèi)纖維涂層的形成，掃描電鏡觀察原位小鼠膀胱DOX@BTN組。膀胱解剖后經(jīng)大體檢查發(fā)現(xiàn)膀胱組織有腫瘤病變，經(jīng)HE染色得到證實(shí)。通過免疫組化染色驗(yàn)證FN表達(dá)和暴露（圖6g;圖S20），纖維結(jié)構(gòu)分布在有腫瘤負(fù)擔(dān)的膀胱表面，這為原位膀胱癌模型中BTN從納米顆粒轉(zhuǎn)化為納米纖維提供了直接和有力的支持（圖6h）。
圖6
圖S20
結(jié)論
受細(xì)菌對(duì)傷口黏附的啟發(fā)，作者成功開發(fā)了一種細(xì)菌誘導(dǎo)的可轉(zhuǎn)化納米顆粒（BTN），用于預(yù)防膀胱癌復(fù)發(fā)。負(fù)載藥物的BTN能夠通過細(xì)菌衍生肽（FBP）與暴露的FN結(jié)合，精確地粘附在殘留腫瘤的手術(shù)部位。在靶向FN的引導(dǎo)下，DOX@BTN轉(zhuǎn)化為纖維涂層，具有長期滯留作用，有助于DOX在殘留腫瘤中的持續(xù)釋放，達(dá)到精確殺傷的目的。作者建立了不*切除模型來模擬術(shù)后殘留腫瘤。在該模型中，DOX@BTN可明顯抑制腫瘤再生。在原位膀胱癌模型中，DOX@BTN組與傳統(tǒng)膀胱內(nèi)灌注（DOX）相比，復(fù)發(fā)率從71%降低到29%。大多數(shù)注射了DOX@BTN的小鼠至少存活了60天。這種BTN不僅為抑制膀胱癌的復(fù)發(fā)提供了一個(gè)全新的視角，而且也是*治愈膀胱癌的*佳臨床替代方案。在臨床實(shí)踐中，這種智能配方為管理其他實(shí)體腫瘤的復(fù)發(fā)提供了機(jī)會(huì)。
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