研究背景

基本信息

摘要

研究內(nèi)容及結(jié)果

1.mMMP13遞送蛋白的篩選

接下來研究AA-PLL-PEG-peptide-PEG-N3（簡稱P-N3）和的mMMP13體外轉(zhuǎn)錄，優(yōu)化了RPL32聚合的mMMP13納米配合物（定義為mMMP13@RP）。該mRNA的封裝效率為91.4±0.030%。隨后，通過靜電吸引和鏈接反應(yīng)制備吸入式mRNA納米制劑（定義為mMMP13@RP/P-KGF）。在透射電鏡（TEM）下，amMMP13@RP/P-KGF呈直徑約250nm的球形（圖2b），這與流體動(dòng)力學(xué)直徑（261.6±2.558，251.2±5.093nm）一致（圖2c）。在TEM圖像中觀察到pH7.4或pH5.5 MMP2預(yù)處理的amMMP13@RP/P-KGF的形態(tài)學(xué)變化（圖2b），在pH7.4條件下，與MMP2孵育后，納米制劑的外殼部分破壞，大部分球形納米顆粒變成不規(guī)則形狀。當(dāng)pH值為5.5時(shí)，納米顆粒周圍出現(xiàn)明顯松散的冠狀層，說明在酸性條件下發(fā)生了電荷逆效應(yīng)。此外，從mMMP13@RP（172.7±3.900nm）到mMMP13@RP/P/P-N3（228.3±3.265nm）和mMMP13@RP/P-KGF（261.6±2.558nm），粒徑逐漸增大，粒子Zeta電位明顯改變（圖2c，d）。這表明P-N3和KGF的嫁接有效。為了進(jìn)一步證實(shí)，用ELISA法測定了KGF的封裝效率，發(fā)現(xiàn)約41.85%的KGF被嫁接到mMMP13@RP/P-KGF的表面。此外，測定了MMP2對amMMP13@RP/P-KGF的反應(yīng)性，并通過ELISA法監(jiān)測KGF的釋放情況。在50×10^?9 _M MMP2孵育6h后，amMMP13@RP/P-KGF釋放出超過50.1%的KGF，比無MMP2孵育組高21倍。在50×10^?9 _M MMP2孵育24h后，約67.2%的KGF被釋放，證實(shí)了amMMP13@RP/P-KGF對MMP2的高敏感性（圖2e）。amMMP13@RP/P-KGF的MMP2應(yīng)答能力證實(shí)了KGF在纖維化灶中的特異性釋放，從而在理論上減少了副作用。

2.吸入式納米制劑在胞內(nèi)傳遞和胞質(zhì)釋放的表現(xiàn)

纖維化肺泡高度表達(dá)MMP2，可以有效引導(dǎo)KGF從納米制劑中釋放。作者比較了MMP2處理前后納米制劑的細(xì)胞毒性（圖3a），沒有檢測到被納米制劑處理或者M(jìn)MP2預(yù)處理的的體外AECs有任何顯著的細(xì)胞毒性作用。隨后，評估了mMMP13@RP/P-KGF促進(jìn)肺泡上皮再生的能力，在圖3b中，MMP2預(yù)處理的amMMP13@RP/P-KGF顯著促進(jìn)了AEC2s的增殖，表明mMMP13@RP/P-KGF在體內(nèi)促進(jìn)上皮再生方面有較大的潛力，進(jìn)一步分析了mMMP13的體外細(xì)胞內(nèi)的遞送情況，通過TGF-β1刺激成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)所得肌成纖維細(xì)胞的表型，用于后續(xù)分析，在IPF的細(xì)胞環(huán)境下，異常激活的肌成纖維細(xì)胞和受損的AEC2s（以A549細(xì)胞為代表），其整合素表達(dá)水平升高，在纖維化病灶中很明顯，因此對IPF的進(jìn)展至關(guān)重要。MMP2預(yù)處理的amMMP13@RP/P-KGF納米制劑分別與成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、AEC2s和A549細(xì)胞孵育6h，以驗(yàn)證在纖維化肺泡中，肌成纖維細(xì)胞和受損的AEC2s是否大量吸收納米制劑，為了觀察細(xì)胞攝取和胞內(nèi)運(yùn)輸，mMMP13被紅色熒光探針（Cy5）標(biāo)記，并封裝在納米制劑中，結(jié)果顯示肌成纖維細(xì)胞和A549細(xì)胞的胞質(zhì)熒光信號強(qiáng)于成纖維細(xì)胞或AEC2細(xì)胞，這一結(jié)果表明了細(xì)胞整合素和RGD環(huán)肽之間的相互作用。共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）顯示，經(jīng)MMP2預(yù)處理的amMMP13@RP/P-KGF處理肌成纖維細(xì)胞和A549細(xì)胞的紅色熒光強(qiáng)度在6小時(shí)強(qiáng)于1或3小時(shí)（圖3c），與未經(jīng)MMP2預(yù)處理的amMMP13@RP/P-KGF孵育的細(xì)胞相比，經(jīng)MMP2預(yù)處理的amMMP13@RP/P-KGF孵育的細(xì)胞熒光信號顯著增強(qiáng)（圖3d，h）。流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)（FCM；圖3e、f、i、j）。此外，還研究了該納米制劑的內(nèi)含體逃逸過程，在amMMP13@RP/P-KGF（經(jīng)MMP2預(yù)處理）處理的肌成纖維細(xì)胞中，隨著孵育時(shí)間的延長，溶酶體（lysosome）綠色熒光與Cy5紅色熒光的重疊逐漸減少，表明納米制劑從內(nèi)含體中成功逃逸（圖3k）。吸入式納米制劑在mRNA胞內(nèi)傳遞和胞質(zhì)釋放顯示出了生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的潛力。

3.體外轉(zhuǎn)染效率評價(jià)

為了在體外觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果，本研究使用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白mRNA（mEGFP）作為模型mRNA來構(gòu)建類似的納米制劑。研究了該納米制劑保護(hù)mRNA免受核糖核酸酶降解的能力，經(jīng)核糖核酸酶處理的amEGFP@RP/P-KGF組的轉(zhuǎn)染效率與未經(jīng)核糖核酸酶處理的amEGFP@RP/P-KGF對照組的轉(zhuǎn)染效率相當(dāng)，表明在核糖核酸酶存在下，納米制劑可以保護(hù)mRNA。用脂質(zhì)體3000（lipo3000）作為標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染試劑，形成lipo3000聚合的mEGFP納米制劑，并與RPL32聚合的mEGFP納米制劑進(jìn)行比較，在RPL32聚合的mEGFP納米制劑組中，可以觀察到更高的轉(zhuǎn)染效率。此外，如圖4a-d所示，在肌成纖維細(xì)胞或A549細(xì)胞中，MMP2預(yù)處理的amEGFP@RP/P-KGF組與amEGFP@RP/P-KGF組的熒光密度和GFP陽性率存在顯著差異，進(jìn)一步驗(yàn)證了MMP2對mMMP13@RP/P-KGF的響應(yīng)特性。通過ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的MMP13，評估其體外表達(dá)情況（圖4e）。結(jié)果表明，與對照組相比，MMP13蛋白水平在24h后仍保持強(qiáng)烈上調(diào)（肌成纖維細(xì)胞增加了39倍，A549細(xì)胞增加了45倍）。

4.mMMP13@RP/P-KGF的體內(nèi)抗纖維化性能

在博萊霉素誘導(dǎo)的IPF小鼠模型中，探索了mMMP13@RP/P-KGF的生物分布。mFluc、mFluc@RP/P和mFluc@RP/P-KGF均被吸入，給藥濃度為0.5mg/mL。生物發(fā)光成像顯示，在mFluc@RP/P和mFluc@RP/P-KGF處理的小鼠中出現(xiàn)了生物發(fā)光信號。值得注意的是，沒有明顯的信號定位于其他器官（心臟、肝、脾和腎），這表明吸入的納米制劑生物分布效果很好。通過WB分析一次吸入mMMP13@RP/P-KGF后MMP13在體內(nèi)的表達(dá)情況，作為確定給藥間隔時(shí)間的參考。此外，通過蘇木精和H&E染色評估納米制劑的潛在毒性，染色切片中未見明顯的組織病理學(xué)異常。這些結(jié)果表明，本研究開發(fā)的給藥系統(tǒng)具有良好的肺滯留能力和生物相容性。隨后，詳細(xì)研究了博萊霉素誘導(dǎo)的IPF小鼠模型的治療效果，如圖5a所示，給予博萊霉素后10天，小鼠隨機(jī)分為6組（n=6），給予PBS、mMMP13@RP/P、mEGFP@RP/P-KGF、mMMP13@RP/P-KGF、吡非尼酮和mMMP13@RP/P-KGF、吡非尼酮處理，每3天給藥5次，mRNA劑量為750µg/kg，未給予博萊霉素誘導(dǎo)組（n=6）以PBS處理作為對照，灌注博萊霉素25d后處死所有小鼠，收集肺組織進(jìn)行組織學(xué)分析，用具有代表性的H&E染色法顯示肺泡結(jié)構(gòu)的完整性，Masson和天狼猩紅染色法顯示膠原蛋白沉積的程度，平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的免疫組化染色法反映肌成纖維細(xì)胞活性（圖5b）。與PBS處理組相比，吸入mMMP13@RP/P和mEGFP@RP/P-KGF在治療期后緩解了IPF，而吸入mMMP13@RP/P-KGF對纖維化消退的影響更顯著。吡非尼酮是一種臨床批準(zhǔn)用于治療IPF的藥物，其可以減少多種促纖維化因子的表達(dá)，防止膠原和炎癥細(xì)胞在肺組織中的積累，與吸入mMMP13@RP/P-KGF在胃內(nèi)聯(lián)合給藥（圖中的G7處理）。在恢復(fù)肺泡上皮結(jié)構(gòu)和減少膠原沉積方面，與單獨(dú)給2種藥相比，聯(lián)合治療顯示出更顯著的療效。通過WB法測定α-SMA的蛋白水平（圖5c），分析α-SMA/β-actin比值（圖5d），結(jié)果表明，在mMMP13@RP/P-KGF和吡非尼酮聯(lián)合給藥組中，其蛋白水平顯著低于PBS處理組。Ashcroft評分和羥脯氨酸含量的進(jìn)一步研究證實(shí)了這些結(jié)果（圖5e，f）。為了驗(yàn)證MMP13在體內(nèi)的表達(dá)，讓IPF小鼠吸入不同的納米制劑（圖5g），WB檢測表明mMMP13@RP/P或mMMP13@RP/P-KGF處理組中MMP13的表達(dá)水平高于對照組或mEGFP@RP/P-KGF處理組（圖5h，i），說明了mMMP13在體內(nèi)的高效傳遞。此外，利用免疫熒光染色法檢測MMP13和α-SMA在治療小鼠肺組織中的共定位，結(jié)果顯示，與MMP13蛋白對應(yīng)的紅色熒光廣泛分布于mMMP13@RP/P處理小鼠的肺組織切片中，相比之下，在mMMP13@RP/P-KGF處理組中，紅色熒光主要出現(xiàn)在纖維化灶中（圖5g）。另外與PBS處理組相比，mMMP13@RP/P-KGF處理組小鼠的體重顯著增加。

5.納米制劑對肺泡修復(fù)和肺功能的影響

基于對博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠模型的整體纖維化水平的分析，進(jìn)一步研究了納米制劑對肺泡修復(fù)和肺功能的影響。在IPF中易感的肺泡上皮主要由介導(dǎo)氣體交換的AEC1s和分泌表面活性物質(zhì)的AEC2s和祖細(xì)胞組成。作者進(jìn)一步研究了博萊霉素?fù)p傷后不同處理組AEC1和AEC2分布的變化，以評估肺泡損傷和修復(fù)。水通道蛋白5（AQP5，AEC1標(biāo)記物）和表面活性蛋白C（SP-C，AEC2標(biāo)記物）的免疫染色顯示，mMMP13@RP/P-KGF處理組和mMMP13@RP/P-KGF和吡非尼酮共同給藥組的AQP5和SP-C明顯升高，結(jié)果表明吸入mMMP13@RP/P-KGF可促進(jìn)肺泡修復(fù)（圖6a-c）。這些結(jié)果通過WB得到證實(shí)（圖6d?f）。隨后，在治療期結(jié)束時(shí)進(jìn)行多次肺功能測試，以監(jiān)測隨機(jī)分組小鼠（n=6）的肺功能變化。結(jié)果與肺泡改善效果一致，總肺活量（TLC）、用力肺活量（FVC）、功能殘氣量（FRC）、最大呼氣流量（PEF）、50ms用力呼氣容積（FEV50）、肺阻力（RL）、肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性（Cdyn） 接近正常水平，mMMP13@RP/P-KGF處理組和mMMP13@RP/P-KGF和吡非尼酮共同給藥組比PBS處理組更明顯（圖6g-m）。Kaplan-Meier生存曲線（圖6n）顯示，與PBS處理組相比，mMMP13@RP/P-KGF和吡非尼酮聯(lián)合處理顯著延長了博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠模型的生存時(shí)間?？偟膩碚f，吸入式mMMP13@RP/P-KGF納米制劑顯著加速了博萊霉素誘導(dǎo)小鼠的受損肺泡上皮再生，并改善了肺功能。

研究結(jié)論